人结肠癌移植瘤小鼠模型的建立方法技术

本发明专利技术公开的人结肠癌移植瘤小鼠模型的建立方法，其将人新鲜结肠癌标本接种于ＢＡＬＢ／ｃ－ｎｕ／ｎｕ裸小鼠及ＢＮＸ小鼠皮下，反复传代５代。分别建立ＢＮＸ小鼠及裸鼠皮下移植瘤，观察生长情况，绘制生长曲线。利用皮下移植瘤组织建立原位移植瘤结肠癌模型，观察成瘤情况及转移情况。移植瘤组织石蜡包埋切片，比较光镜下与原结肠癌组织有无组织学差异，免疫组织化学检测石蜡切片ＥＳＡ，ＣＥＡ，Ｃ－ｅｒｂＢ－２，Ｐ５３在皮下瘤的表达，流式细胞技术检测该肿瘤的细胞周期及倍体。本发明专利技术利用人结肠癌组织成功建立结肠癌皮下及原位移植瘤模型，该模型生物学稳定，保持了原代肿瘤的特点。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及肿瘤模型的建立方法，特别涉及人结肠癌移植瘤小鼠模型的建立方 法。
技术介绍
结肠癌是常见的消化道恶性肿瘤之一，其发病率在我国仅次于肺癌、胃癌、肝癌、 食管癌，据2004-2005年全国城乡主要恶性肿瘤估计分析，结肠癌新发病例数达20万，死 亡人数达10万，在美国结肠癌是第三大常见的肿瘤，2008年估计有149000新发病例，近 50000人死于结肠癌。目前我国结、直肠癌的发病率与大部分恶性发病率逐年下降相反，每 年新发病病例约增加2 %。结肠癌的标化发病率迅速上升，与1972年比，2000年标化发病 率男性增加134%，女性增加135%。肿瘤模型是研究肿瘤的重要手段，肿瘤模型一般可分为自发性肿瘤模型、诱发性 肿瘤模型、移植性肿瘤模型和转移性肿瘤模型。肿瘤实验研究中选用自发性肿瘤模型为对 象进行研究有一定优点首先是自发性肿瘤通常比用实验方法诱发的肿瘤与人类所患的肿 瘤更为相似，有利于将动物实验结果推用到人；其次是这一类肿瘤发生的条件比较自然，有 可能通过细致观察和统计分析发现原来没有发现的环境的或其它的致癌因素，可以着重观 察遗传因素在肿瘤发生上的作用。但应用自发性肿瘤模型也存在一些缺点肿瘤的发生情 况可能参差不齐，不可能在短时间内获得大量肿瘤学材料，观察时间可能较长，实验耗费较 大。Miwa等报道在三年观察3000例雄性Wistar大鼠中仅发现28例结肠癌。诱发性肿瘤 大多采用致癌剂诱发肿瘤，常用二甲基胼(DMH)和氧化偶氮甲烷(AOM)，选择合适的致癌剂 及适当的动物可以在短时间内获得一批合适的模型，适用于病因学的研究，但是模型所患 肿瘤来源于动物，在基因上与人体存在一定的差异；诱发性肿瘤实验因环保问题需要防护 设施，实验条件要求高。而移植性肿瘤一般由相应的细胞株建立起来，可供选择的细胞系或 细胞株较多，这些细胞的生物学特性比较明确，背景资料比较清楚，动物接种一定数量的肿 瘤细胞后，可以使一群动物带有同样的肿瘤，生长速率比较一致，个体差异较小，接种成活 率较高，甚至可达100%，宿主的荷瘤寿命比较接近，易于客观地判断疗效，而且移植瘤可进 行连续传代，模型重复性好，同自发性肿瘤和诱发性肿瘤相比，它的试验周期一般比较短。 所以移植性肿瘤模型目前被广泛应用于肿瘤研究。转移性动物模型大多由移植性模型发展 而来，再现了肿瘤的转移等生物学特性，用于肿瘤侵袭以及转移机理的研究。近年来，由于 基因打靶技术和基因剔除技术的兴起，各种转基因动物得到广泛应用，但并未能建立单纯 的自发和转移结肠癌模型。自1969年Rygaard和Povlsen等首次将人类结肠癌移植于裸小鼠体内，成功地 建立了人类肿瘤裸小鼠皮下移植模型后，由裸小鼠等免疫缺陷动物来建立结肠癌模型的方 法得以迅速地推广和应用。D，GUenot等用手术后的临床各期人结肠癌组织块移植至裸鼠， 建立移植瘤模型并传代研究，共传代14代，检测移植瘤的基因突变位点，发现肿瘤的遗传 特性和组织学特性得到完整保存。皮下种植瘤模型具有成功率高，操作简单，便于观察，肿瘤生长速度快等优点，是研究实体瘤生长、相关肿瘤因子检测、药物疗效评定等较好的病理 模型。然而，肿瘤在皮下生长时受微环境的影响，肿瘤转移率极低，不能充分显示结肠癌的 生长特点。1986年Mofikawa等成功将人结肠癌细胞种植到裸鼠盲肠浆膜下，建立结肠癌 的原位模型。Hoffman等于1991年创立了外科原位移植方法，即采用的移植物直接来自 新鲜外科标本或移植性人肿瘤组织，通过手术原位移植于裸鼠盲肠浆膜下建立肿瘤模型。 Dvory-Sobol等应用此方法从浆膜下注射0. Iml的活性癌细胞(lX106/ml)到盲肠壁，注 射14d后可以明显观察到盲肠肿瘤。CSspedes等采取此法将HCT-116、SW-620、DLD-I细 胞悬液在显微镜引导下用微量器注射到盲肠壁黏膜和肌层之间，结果观察到肿瘤生成率为 75% -88% ；不同程度的肠系膜和肠系膜后淋巴结转移癌发生率为57% -100%，血行播散 到肝脏发生率为29% -67%、肺29% -100%、腹膜播散为29% -100%。结肠癌原位种植模 型的肿瘤既可在原位生长，又可出现肝脏转移，不但拥有较高的移植生长率，而且依据患者 的情况在宿主体内展示其肿瘤生物学行为及转移，比结肠癌皮下种植瘤模型更能代表临床 结肠癌的生长特点，是一种更接近人体肿瘤发生、发展过程的模型。同时也是结肠癌肝转移 的理想模型，适合结肠癌晚期和远处肝转移的研究。利用现有的结肠癌细胞株建立各种模 型，我国学者已做了较多相关方面的研究，周琪等利用人结肠癌细胞株Lovo建立原位移植 瘤模型，并形成了广泛转移；牛洪欣等用人结肠癌细胞株SW480建立原位模型，获得肝转移 及腹腔广泛转移的动物模型。张杰等利用人结肠癌细胞株HCT116建立皮下移植瘤，并反复 切瘤建立结肠癌肺转移模型。涂经楷等利用HCT116建立结肠癌单纯淋巴结转移的模型[。 利用已有结肠癌细胞株建立模型，遗传学背景清晰，实验资料丰富，成瘤率高而且稳定，实 验时间短，优势明显。但目前应用于广泛研究的结肠癌细胞株相当有限，而且大多来源于国 外。我国作为一个人口大国，地域辽阔，多民族，多种族，与国外人群在基因和表型上有较大 差异，采用国外的细胞株并不能完全代表我国人群结肠癌生物学特性。而且每一例结肠癌 在发病机理，基因表型以及生物学特性有较大差异，在强调肿瘤个体化治疗的今天，细胞株 模型更不能满足结肠癌的进一步研究。利用人结肠癌组织建立皮下移植瘤模型，我国学者 也做过一些探索，早在上个世纪八十年代吴秉铨等用乙结肠粘液腺癌标本建立皮下移植瘤 模型，共传代18代，并建立腹水肿瘤模型；傅红等利用右半结肠高分化管状腺癌标本建立 皮下移植瘤模型，观察其生物学特性；贺子彪等用人结肠癌组织块贴壁培养后利用培养的 细胞建立了皮下移植瘤模型[；但均未建立原位模型作进一步研究。虽然利用低，中，高分化 的结肠癌组织建立移植瘤均有报道，但近年来由于利用肿瘤组织建立移植瘤模型时间长， 国内学者利用人结肠癌组织建立原位移植瘤模型相当少。本实验利用人新鲜结肠癌标本建 立皮下移植瘤模型，再利用皮下移植瘤组织分别移植于两种不同免疫缺陷小鼠，进行病理 形态学观察，免疫组化实验，观察其生长情况；建立原位模型，观察肿瘤生长及转移情况，为 建立新的细胞系作基础工作。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题在于针对现有人结肠癌模型的建立方法所存在的问 题而提供一种，该方法利用人结肠癌组织成功建立结 肠癌皮下及原位移植瘤模型，该模型生物学稳定，保持了原代肿瘤的特点。本专利技术所要解决的技术问题可以通过以下技术方案来实现—种，其特征在于，包括如下步骤(1)小鼠皮下移植瘤模型的建立(2. 1)将肿瘤组织放置在含庆大霉素的生理盐水中浸泡2min，取出组织，反复用 生理盐水冲洗三分钟，冲洗后标本组织无血液，将肿瘤组织用无菌眼科剪分割成直径1. 5mm 大小，放在无菌培养皿中；(2. 2)用20号套管针把剪好的肿瘤组织分别移植到裸小鼠及BNX小鼠右侧背部近 腋部皮下，压迫伤口，无出血。每次套管针在电热真空灭菌器中灭菌； (2. 3)将小鼠放入小鼠IVC系统饲养；(2.4)等待肿瘤形成约本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种人结肠癌移植瘤小鼠模型的建立方法，其特征在于，包括如下步骤：（１）小鼠皮下移植瘤模型的建立（２．１）将肿瘤组织放置在含庆大霉素的生理盐水中浸泡２ｍｉｎ，取出组织，反复用生理盐水冲洗三分钟，冲洗后标本组织无血液，将肿瘤组织用无菌眼科剪分割成直径１．５ｍｍ大小，放在无菌培养皿中；（２．２）用２０号套管针把剪好的肿瘤组织分别移植到裸小鼠及ＢＮＸ小鼠右侧背部近腋部皮下，压迫伤口，无出血。每次套管针在电热真空灭菌器中灭菌；（２．３）将小鼠放入小鼠ＩＶＣ系统饲养；（２．４）等待肿瘤形成约１５ｍｍ左右，无菌切除皮下肿瘤，选择实性肿块，取材剪成１．５ｍｍ３小块，移植于另外小鼠，传三代；（３）结肠癌原位模型的建立（３．１）利用实验二所获得的第四代裸小鼠皮下移植瘤作为瘤源，将肿瘤组织放置在含庆大霉素的生理盐水中浸泡２ｍｉｎ，取出组织，反复用生理盐水冲洗３ｍｉｎ，冲洗后标本组织无血液，将肿瘤组织用无菌眼科剪分割成直径１．５ｍｍ大小，放在无菌培养皿中备用；（３．２）裸小鼠８只，禁食１２ｈ，３％戊巴比妥溶液麻醉裸小鼠；（３．３）将小鼠仰卧固定于操作台上，７５％酒精消毒皮肤；（３．４）取腹部正中切口，寻找到盲肠，钳出盲肠，于盲肠末端用手术刀背轻轻划破浆膜面，用无齿镊将盲肠末端向内推压，使局部形成壁龛，将直径１．５ｍｍ的肿瘤组织塞入壁龛内，表面滴生物蛋白胶，使胶覆盖瘤体表面，与盲肠粘合好，将盲肠回纳入腹腔，３－０可吸收线连续缝合关腹；（３．５）伤口再次消毒后进入ＩＶＣ系统饲养；（４）．观察项目（４．１）分别记录每一次皮下移植瘤小鼠肿瘤生长情况及成瘤率，皮下移植瘤等待肿瘤生长到１．５ｍｍ时，取第四代裸小鼠皮下移植瘤标本，将肿瘤组织１０％甲醛固定，石蜡包埋，切片ＨＥ染色。（４．２）观察原位模型的肿瘤生长情况，人结肠癌组织原位移植后，定时观察裸小鼠的全身状况，运动情况，腹部体征。当荷瘤小鼠出现明显消瘦，弓背，精神萎靡等衰竭体征时将裸鼠处死，解剖原位移植模型，观察原位肿瘤生长情况，腹腔脏器转移情况及淋巴结转移情况。...

【技术特征摘要】
一种人结肠癌移植瘤小鼠模型的建立方法，其特征在于，包括如下步骤(1)小鼠皮下移植瘤模型的建立(2.1)将肿瘤组织放置在含庆大霉素的生理盐水中浸泡2min，取出组织，反复用生理盐水冲洗三分钟，冲洗后标本组织无血液，将肿瘤组织用无菌眼科剪分割成直径1.5mm大小，放在无菌培养皿中；(2.2)用20号套管针把剪好的肿瘤组织分别移植到裸小鼠及BNX小鼠右侧背部近腋部皮下，压迫伤口，无出血。每次套管针在电热真空灭菌器中灭菌；(2.3)将小鼠放入小鼠IVC系统饲养；(2.4)等待肿瘤形成约15mm左右，无菌切除皮下肿瘤，选择实性肿块，取材剪成1.5mm3小块，移植于另外小鼠，传三代；(3)结肠癌原位模型的建立(3.1)利用实验二所获得的第四代裸小鼠皮下移植瘤作为瘤源，将肿瘤组织放置在含庆大霉素的生理盐水中浸泡2min，取出组织，反复用生理盐水冲洗3min，冲洗后标本组织无血液，将肿瘤组织用无菌眼科剪分割成直径1.5mm大小，放在无菌培养皿中备用；(3.2...

【专利技术属性】
技术研发人员：闫明霞，姚明，万伯顺，胡晓丽，刘蕾，李静，施中凯，赵方瑜，朱淼鑫，萨冰清，
申请(专利权)人：上海市肿瘤研究所，
类型：发明
国别省市：31[]