一种快速检测格列苯脲及其衍生物的胶体金层析试纸条及制备方法技术

本发明专利技术公开一种快速检测格列苯脲及其衍生物的胶体金层析试纸条，由衬板和在衬板上依次衔接的样品垫、金标结合垫、包被膜和吸水垫组成，金标结合垫为吸附格列苯脲衍生物的金标抗体的聚酯纤维毡，在包被膜上有用格列苯脲衍生物偶联的载体蛋白溶液包被直线式检测线Ｔ线，和用羊抗鼠ＩｇＧ溶液包被直线式对照线Ｃ线，两条线竖向平行排列。其具体步骤：制备人工结合抗原；制备格列苯脲衍生物的单克隆抗体；制成胶体金溶液；获得抗格列苯脲衍生物单克隆抗体的胶体金标记物和金标结合垫。本发明专利技术具有特异性强，敏感度高，简便、快速、时效性强，结果显示形象、准确的优点。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及， 属于生物学免疫方法的检测

技术介绍
格列苯脲是磺脲类口服降血糖药，适用于单用饮食控制疗效不满意的轻、中度非 胰岛素依赖型糖尿病，病人胰岛B细胞有一定的分泌胰岛素功能，并且无严重的并发症，用 于非胰岛素依赖型(成年型、肥胖型)的糖尿病患者。近几年来，一些不法生产企业为牟取 暴利，在未经获得批准的情况下，在治疗糖尿病的中药或是保健品中非法加入价格相对低 廉、起效快的格列苯脲等降糖西药是十分普遍的现象，据五个省市对市面上销售的32种宣 称具有降糖作用中药及中药保健品进行的抽样化验检查发现，70%的药物中都非法添加有 降糖西药成分。格列苯脲的降糖作用为甲苯磺丁脲的100-200倍，治疗量范围大，降糖作 用，半减期12-14小时，维持时间长，易引起低血糖昏迷，特别是老年人。因为老年人摄食 少，抗胰岛素激素如胰高血糖素，肾上腺素分泌反应障碍均可诱发低血糖，再者老年人糖尿 病性植物神经病变，急性低血糖症状可以被掩盖，低血糖昏迷如持续6小时以上引起大脑 功能损害可能是不可逆的，主要是神经元广泛变性、坏死，大小神经胶质细胞浸润。神经系 统中大脑皮质、海马回，小脑、尾状核，苍白球处低血糖最为明显。所以格列苯脲必须由医生 处方才可使用。在治疗糖尿病的中药或保健产品非法加入格列苯脲而不标明药物成分和剂 量，使得医生和患者都无法预知和掌握可能有的毒副作用，极易导致出现药物不良反应；而 一些患者往往会在服用医生治疗用处方药的同时服用保健食品，造成摄入过量药物中毒， 加剧病情，严重的甚至危及患者生命。所以，为了保证人民群众的饮食用药安全，我们必须 加大力度打击这种现象。然而近年来，不法分子非法生产的手段日趋隐蔽，而且由于中药成 分比较复杂，检测难度较大，需要精密的分析仪器和专业技术人员，因而造成监管部门监督 抽验成本很大，收效却不甚理想。
技术实现思路
本专利技术的目的是为了克服以上的不足，提供一种能快速、灵敏、简便地检测格列苯 脲衍生物的格列苯脲胶体金层析检测试纸条及制备方法。本专利技术是通过以下技术方案来实现一种快速检测格列苯脲及其衍生物的胶体金 层析试纸条，由衬板和在衬板上依次衔接的样品垫、金标结合垫、包被膜和吸水垫组成，金 标结合垫为吸附格列苯脲衍生物的金标抗体的聚酯纤维毡，在包被膜上有用格列苯脲衍生 物偶联的载体蛋白溶液包被直线式检测线τ线，和用羊抗鼠IgG溶液包被直线式对照线C 线，两条线竖向平行排列。衬板为不吸水的PCV韧性材料。包被膜为硝酸纤维素膜，或混合 纤维素膜。吸水垫为植物纤维棉纸。格列苯脲衍生物的金标抗体为胶体金标记的抗格列苯 脲衍生物的单克隆抗体复合物，偶联格列苯脲衍生物的载体蛋白为牛血清白蛋白BSA。一种快速检测格列苯脲及其衍生物的胶体金层析试纸条的制备方法，制备偶联格 列苯脲衍生物的载体牛血清白蛋白BSA，用于制备相应的检测线T线；制备偶联格列苯脲衍 生物的载体鸡卵清白蛋白，用于制备单克隆抗体，制备格列苯脲衍生物金标抗体，用于制备 吸附格列苯脲衍生物金标抗体的聚酯纤维毡；制备羊抗鼠IgG抗体，用于制备对照线C线， 包括如下步骤(A)将格列苯脲衍生物与载体牛血清白蛋白BSA/鸡卵清白蛋白OVA进行偶联制备人工 合成抗原；a、生成水溶性碳化二亚胺(EDC):往反应瓶中加入干燥的二甲基甲酰胺(DMF)及那非类 原料或拉非类原料，并通N2保护，在室温下进行搅拌，待二甲基甲酰胺(DMF)完全溶解后，快 速称取浓度为60%的氢化钠(NaH)，并将其加入所述反应瓶中，搅拌50-70分钟，直至溶液 无气泡产生，然后用注射器吸取溴乙酸乙酯慢慢注入所述反应瓶中，注入完毕后，在室温下 搅拌11-13小时，之后将反应液倾入水中分散，以氯仿进行提取，合并提取液，以无水Na2SO4 进行干燥，之后过滤，再经过减压浓缩后得到固体，加入无水乙醚打浆洗涤所述固体，之后 进行过滤，最后真空干燥得到新的固体，此固体为烷基化物；将无水乙醇和上述步骤所得的 烷基化物加入新的反应瓶中，进行搅拌分散，再加入NaOH溶液，加热回流反应2小时，停止 加热稍冷却后，将反应液转入单口瓶中，减压浓缩得糊状物，再加入水，以盐酸调节至PH值 为7-9的液体，以氯仿进行提取，合并提取液，再用饱和食盐水洗一次，以无水Na2SO4干燥， 过滤，减压浓缩得白色固体，用甲醇重结晶，得白色粉状固体，此固体为水溶性碳化二亚胺 (EDC)；b、生成人工合成抗原将上述步骤中所得的水溶性碳化二亚胺(EDC)、N-羟基琥珀酰 亚胺(NHS)、二甲基甲酰胺(DMF)、半抗原化合物平衡至室温；取上述步骤中所得的水溶性 碳化二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺和半抗原化合物，三者的摩尔比为半抗原化合物水溶性 碳化二亚胺N-羟基琥珀酰亚胺=1 8-12 :13-16，将其置入圆底烧瓶，然后加入上述步骤 中所得的二甲基甲酰胺溶解，为保证反应完全，在室温避光的条件下进行搅拌，最后生成的 溶液记为二号反应液；当所述水溶性碳化二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺和半抗原化合物在二 甲基甲酰胺中反应完全后，现配载体蛋白溶液(BSA / 0VA)，将载体蛋白与硼酸缓冲液按 1:0. 15-0.2的量溶解于另一容器中的硼酸缓冲液，然后转入另一圆底烧瓶中，此溶液记为 三号反应液；将二号反应液按每10秒1滴的速度滴入三号反应液中，直至将二号的反应液 加完后，先在室温避光的条件下进行搅拌，之后在3-5 °C条件下避光搅拌，待反应完全后，生 成溶液，并将生成的溶液记为四号反应液，四号反应液中载体蛋白与半抗原化合物比例为 1:15-25 ；等所有反应结束后，将四号反应液置于20000-30000分子截留透析袋中，透析袋 中还装有0. 01-0. 02M磷酸盐缓冲液，pH值为7. 0-7. 5，将透析袋在3_5°C的条件下进行透 析，每隔3-5小时换一次磷酸盐缓冲液；经上述透析步骤最终所得的产品，经冷冻干燥为白 色絮状产品，即为人工合成抗原。(B)将人工合成抗原OVA按常规方法免疫制备格列苯脲衍生物的单克隆抗体细胞 株，用Babc小鼠免疫制备抗体腹水，将腹水纯化得到高纯度的单克隆抗体蛋白，测定蛋白 浓度，备胶体金标记用；(C)用柠檬酸三钠还原剂将氯金酸还原制成20nm-40nm的胶体金溶液；(D)用0.lmol/LK2C03调节胶体金溶液至最适PH值(8. 5-9. 0)，将适量纯化的单克隆5抗体纯水透析(4hr)后，加入胶体盆中，室温电磁搅拌(15-30min)，逐滴加入1%络蛋白溶液，使络浓度为0. 1%，持续搅拌5min，4°C下15000rpm离心lOmin，弃去上清去沉淀物，将沉 淀物用重悬液重新恢复至原体积混勻，再次离心一次，用重悬溶液将沉淀物混悬至原体积 1/20，4°C保存备用，即获得抗格列苯脲衍生物单克隆抗体的胶体金标记物，重悬液为含5% 海藻的0. 02Tris-HCL缓冲液；(E)将1 :20-1:10稀释的格列苯脲衍生物胶体进标记抗体喷涂吸附于聚酯纤维毡中， 27°C保温干燥，制备格列苯脲衍生物金标结合垫；(F)在包被膜上用格列苯脲衍生物偶联的载体牛血清白蛋白BSA溶液包被直线式检测 线T线，用羊抗鼠IgG溶液包被直线式对照线C线，两条线竖向平行排列；(G)试纸条的组装将样品垫、金标本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种快速检测格列苯脲及其衍生物的胶体金层析试纸条，其特征在于：由衬板（１）和在衬板（１）上依次衔接的样品垫（２）、金标结合垫（３）、包被膜（４）和吸水垫（５）组成，金标结合垫（３）为吸附格列苯脲衍生物的金标抗体的聚酯纤维毡，在包被膜（４）上有用格列苯脲衍生物偶联的载体蛋白溶液包被直线式检测线Ｔ线（６），和用羊抗鼠ＩｇＧ溶液包被直线式对照线Ｃ线（７），两条线竖向平行排列。

【技术特征摘要】
一种快速检测格列苯脲及其衍生物的胶体金层析试纸条，其特征在于由衬板(1)和在衬板(1)上依次衔接的样品垫(2)、金标结合垫(3)、包被膜(4)和吸水垫(5)组成，金标结合垫(3)为吸附格列苯脲衍生物的金标抗体的聚酯纤维毡，在包被膜(4)上有用格列苯脲衍生物偶联的载体蛋白溶液包被直线式检测线T线(6)，和用羊抗鼠IgG溶液包被直线式对照线C线(7)，两条线竖向平行排列。2.根据权利要求1所述一种快速检测格列苯脲及其衍生物的胶体金层析试纸条，其特 征在于所述衬板(1)为不吸水的PCV韧性材料。3.根据权利要求1或2所述一种快速检测格列苯脲及其衍生物的胶体金层析试纸条， 其特征在于所述包被膜(4)为硝酸纤维素膜，或混合纤维素膜。4.根据权利要求1所述一种快速检测格列苯脲及其衍生物的胶体金层析试纸条，其特 征在于所述吸水垫(5)为植物纤维棉纸。5.根据权利要求1所述一种快速检测格列苯脲及其衍生物的胶体金层析试纸条，特 征在于格列苯脲衍生物的金标抗体为胶体金标记的抗格列苯脲衍生物的单克隆抗体复合 物，所述偶联格列苯脲衍生物的载体蛋白为牛血清白蛋白BSA。6.一种快速检测格列苯脲及其衍生物的胶体金层析试纸条的制备方法，其特征在于 制备偶联格列苯脲衍生物的载体牛血清白蛋白BSA，用于制备相应的检测线T线(6)；制备 偶联格列苯脲衍生物的载体鸡卵清白蛋白，用于制备单克隆抗体，制备格列苯脲衍生物金 标抗体，用于制备吸附格列苯脲衍生物金标抗体的聚酯纤维毡；制备羊抗鼠IgG抗体，用于 制备对照线C线(7)，包括如下步骤(A)将格列苯脲衍生物与载体牛血清白蛋白BSA/鸡卵清白蛋白OVA进行偶联制备人工 合成抗原；a、生成水溶性碳化二亚胺(EDC):往反应瓶中加入干燥的二甲基甲酰胺(DMF)及那非类 原料或拉非类原料，并通N2保护，在室温下进行搅拌，待二甲基甲酰胺(DMF)完全溶解后，快 速称取浓度为60%的氢化钠(NaH)，并将其加入所述反应瓶中，搅拌50-70分钟，直至溶液 无气泡产生，然后用注射器吸取溴乙酸乙酯慢慢注入所述反应瓶中，注入完毕后，在室温下 搅拌11-13小时，之后将反应液倾入水中分散，以氯仿进行提取，合并提取液，以无水Na2SO4 进行干燥，之后过滤，再经过减压浓缩后得到固体，加入无水乙醚打浆洗涤所述固体，之后 进行过滤，最后真空干燥得到新的固体，此固体为烷基化物；将无水乙醇和上述步骤所得的 烷基化物加入新的反应瓶中，进行搅拌分散，再加入NaOH溶液，加热回流反应2小时，停止 加热稍冷却后，将反应液转入单口瓶中，减压浓缩得糊状物，再加入水，以盐酸调节至PH值 为7-9的液体，以氯仿进行提取，合并提取液，再用饱和食盐水洗一次，以无水Na2SO4干燥， 过滤，减压浓缩得白色固体，用甲醇重结晶，得白色粉状固体，此固体为水溶性碳化二亚胺 (EDC)；b、生成人工合成抗原将上述步骤中所得的水溶性碳化二亚胺(EDC)、N-羟基琥珀酰 亚胺(NHS)、二甲基甲酰胺(DMF)、半抗原化合物平衡至室温；取上述步骤中所得的水溶性 碳化二亚胺、N...

【专利技术属性】
技术研发人员：欧卫军，吴迪宏，
申请(专利权)人：南通市伊士生物技术有限责任公司，
类型：发明
国别省市：32[中国|江苏]