荧光纳米显微方法技术

本发明专利技术涉及借助荧光显微镜对由荧光着色剂染色的物体实施分析。显微镜包括用于使样本图像可视化并将其投射到摄像机上的光学系统、用于记录和处理图像的计算机、布置在样本透镜前面的样本保持器以及荧光放射源。单独荧光可视的分子和纳米颗粒在物体不同的部分周期性的形成。激光产生的振荡足以记录所述分子和纳米颗粒的非重叠图形并使已经得到记录的荧光分子脱色。所记录的单个分子和纳米颗粒图像的画面通过计算机进行处理，以研究应变中心的坐标并根据与各个荧光分子和纳米颗粒的坐标相对应的应变中心的计算坐标建立物体图像。所述本发明专利技术可以获得分辨率大于２０纳米的二维和三维图像并通过用不同的着色剂使蛋白质、核酸和脂类染色来记录彩色图像。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及科研设备，尤其涉及透镜荧光显微镜。这种显微镜被用于获取固定 在玻璃上的荧光物体的图像。更具体地，本专利技术是一种以达到几纳米(nm)的分辨率重建 物体图像的计算机化荧光显微方法。
技术介绍
已知的光学显微镜可以利用物镜形成放大的物体图像，所述物镜仅在物体上的 两个点之间的距离大于通常所称的衍射极限时才可以分别显示它们。该极限可以采用以 下公式进行计算Γ = 0.61λ/Α(1)，式中入-通过孔径为八=11*8111((^)的物镜聚集的 光的波长，η-物体点周围的物质的折射率，Φ-在物镜轴线与落入物镜内并在检测器中 发现的极端射线之间的角度。现在采用不同类型的设备通过物镜进行荧光显微。大功率 弧光灯、白炽灯、激光或日光可以作为显微镜的光源。荧光产生于光照区域中存在的所 有染料分子。采用分光分色镜通过物镜使所述区域得到光照。所述分色镜使射出的光落 在物体上并将荧光反射到检测器。第二种类型的光照通过从侧面发送激光来产生。这样 以总的内部反射角向下或穿过物镜一直到照射物体。在这种情况下，光仅达到距玻璃与 折射率低于玻璃的物体之间的边界0.3倍波长的深度。物体荧光由物镜聚集。其发送可 以目测并通过光电倍增器、摄影带或数字摄像机记录的物体图像。所有现有的透镜显微 镜的主要缺陷是它们具有对于相邻两点的分辨率的极限。这一极限可以根据公式(1)进 行计算。近年来已经研发了采用由银盐胶片(silverfilm)制成的超透镜进行显微。胶 片厚度小于50纳米；可以确保两个点的分辨率距离相互大致为50纳米。(N.Fang and X.Zhang, Imaging properties of ametamaterial superlens (元物质超透镜的成像特性)， 2003, App physLet v.82, 2, 161-163; Nicholas Fang, Zhaowei Liu, Ta-Jen Yen, andXiang Zhang Regenerating evanescent waves from a silver superlens (来自银盐超透镜的再 生损耗波)，2003，OPTICS EXPRESS, Vol.11, No.7，682-687)。然而在生物体上采用 这些显微镜还不是很清楚。当前显微镜模组的分辨率比我们在此提出的设备的分辨率低 几倍。存在着最大分辨率大于例如1纳米的设备，电子、隧道和原子力显微镜。应该 注意到它们不仅具有真实的优点，而且具有严重的缺陷，例如它们的设计和对物体的 操作复杂而且昂贵；缺乏接收彩色图像以区别不同类型分子的能力；物体通常必须得到 干燥并利用改变物体不同部分相互排列的物质进行处理。原子力和隧道显微镜还不能检 测物体内的结构；一次只能检测一个点并且扫描速度不超过每分钟1平方微米；针的末 端很容易变脏并且此后不能达到物体表面。还有一种设备，其中通过激光穿过玻璃纤维末端上的针孔发射物体荧光。通过 驱动装置使纤维在三个方向移动以使纤维末端定位在光反射、光漫射或涂有荧光的分子 表面附近。这种类型的显微镜不采用透镜并且可以获得分辨率比普通光学显微镜大十倍的图像。仅当玻璃纤维末端上的针孔直径小于光的波长时才能实现这样的结果。光在物 体上达到的深度比光的波长小得多。实际上，所有的光回到玻璃纤维内，除了物体从孔 的外部收集的那部分。通过光电倍增器测定物体在孔附近收集的荧光、光漫射和反射光 强度。通过计算机采集有关测定光的强度的信息以及有关玻璃纤维末端坐标的数据来重 建物体表面的图像。这一系统的主要缺陷是需要采用昂贵的高精度和快速作用的机械 单元，其负责相对物体移动玻璃纤维；制造端孔直径小于50纳米的玻璃纤维非常昂贵、 复杂和难以复制；孔很容易变脏并在此后不能达到物体表面；仅有很少一部分光可以穿 过直径小于光波长的孔离开纤维；增加光强会导致纤维末端过热和损坏；不能对玻璃纤 维接触不到的物体区域上的荧光进行检测；一次只能检测一个点，表面扫描速度不超过 每分钟1平方微米。介绍一种更新类型的显微镜。其利用几个光束同时扫描物体表面。 National Institute of Standards and Technology(NIST)公布了关于形成这种显微镜的 5 年的研究工作成果(http://www.betterhumans.com/News/news.aspx ？ articleID = 2005-02-11-4， “ Optical Microscopes Enter the Nano (光学显微镜进入纳米时代)。研发混合系统对小于可见光波长的特征进行成像和测定)。在文章中指出，采用这种方法可 以区分40纳米的纳米级颗粒。作者没有暗示可以成功地区分相互距离小于40纳米的两 个单独的颗粒。从所提出的附图和说明书中不能清楚地了解到该方法怎样区分之间距离 小于r< 0.61 λ/A的两个颗粒。据我们看来，所提出的设备不能达到距离比光波长小的 多的物体细部的分辨率。采用普通荧光显微镜的方法(Erwen，ASharonov, JHFerris, RM Hochstrasser Direct visualization of nanopatterns bysingle-molecule im a ging (通过单个分子成像实现纳米方式的直接可视化).App Phys Let 2005，86 043102)被认为是与本专利技术最接近的。该 方法的主要思想是利用非常低浓度的荧光肽对样本-由具有1微米直径自由开口的球形细 胞的聚合物制成的光胶片_进行染色。所述浓度可以对在布朗(Brownian)运动中移动到 中空球内的单个肽分子进行观测。通过激光束穿过物镜照射样本。照射角等于总的内 部反射角。激光束激发玻璃附近150-200微米样本层中的荧光。通过高灵敏的摄像机 (RoperScie π tific, Cascade 512F with electrons multiplier builtin CCD (具有在 CCD 中构建 的电子倍增器的级联512F))以500顺序帧检测各自通过同时向分子发荧光而得到染色的 荧光肽几十个分子的位置。每个帧被记录到计算机存储器内。每个图像包含许多直径大 致0.5微米的点，这些点以系统放大值得到倍增。所有的这些图像相互叠加。最终图像 的分辨率不超过普通荧光显微镜的分辨率。该系统的主要缺陷是文章中没有关于能够 计算检测点中心位置以根据这些点产生分辨率高于衍射极限的图像(参见公式1)；文章 中没有描述选择性地对物体结构进行染色的方法；对解决以下问题没有任何描述染色 后在检测观测区域中非荧光肽分子的过程中物质将释放颜色。这样将使溶液更厚并且不 能用新的荧光分子替换所述荧光分子。这样不能获得大于500帧的更大数量。接收分辨 率比衍射极限(参见公式1)所允许的更大的图像就需要大数量的帧。生物体例如肌肉的研究特征在于存在许多不同类型的分子，它们的定位比通过 物镜在记录器_眼睛、照片或摄像机平面上形成物体放大图像的普通光学显微镜的分辨 率更靠近。显微镜分辨率(公式1)的衍射极限通过同时观测在观测区域中的所有点限制显微镜的分辨率，并且通过聚焦在一个点上本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种对染色物体进行纳米显微的方法，包括：通过将非荧光染料分子转化成荧光染料分子产生荧光分子；激发染色物体的荧光分子，其中每个得到激发的荧光分子具有一颜色；将每个得到激发的荧光分子记录为单个点；使荧光分子脱色；多次重复激发和记录步骤的循环；采用所述点计算荧光分子的坐标；以及由在重复循环中记录为点的荧光分子坐标形成图像。

【技术特征摘要】
RU 2005-5-18 20051150521.一种对染色物体进行纳米显微的方法，包括通过将非荧光染料分子转化成荧光染料分子产生荧光分子；激发染色物体的荧光分子，其中每个得到激发的荧光分子具有一颜色；将每个得到激发的荧光分子记录为单个点；使荧光分子脱色；多次重复激发和记录步骤的循环；采用所述点计算荧光分子的坐标；以及由在重复循环中记录为点的荧光分子坐标形成图像。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，还包括采用装有一个或多个摄像机和滤色器的荧光显微镜检测得到激发的荧光分子，所述 滤色器用于采集得到激发的染色物体的荧光，所述一个或多个摄像机能够检测具有由激 光激发的单独的发光的荧光分子图像的低噪声级帧，所述显微镜还装有用于记录从摄像 机接收的图像的可记录介质；通过利用化学反应或物理效应将一个或多个摄像机投影区域中的非荧光染色分子转 化成荧光染色分子而产生荧光分子；采用一个或多个摄像机将每个得到激发的焚光分子作为单个点记录在图像帧上； 将具有新形成的荧光分子的序列帧保存在可记录介质上； 多次重复这一循环；以及采用保存的帧由接收的多个单独的荧光分子图像计算分子距点中心的位置和强度分 布，位置或分布在序列帧上具有不同位置，这些位置与荧光分子的坐标相对应，其中荧 光分子的位置计算提供比得上发荧光分子的尺寸的分辨率，达到几纳米；这一过程向位于距玻璃不超过150纳米距离的物体层提供了分子结构的分辨率并根 据物体结构的灵活性为更大距离提供分辨率。3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，荧光分子在它们的荧光作为具有强度的点 得到记录以允许计算荧光分子的位置或在每个帧上得到记录之后脱色。4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，还包括利用染料的饱和浓度对处于溶液中的物体进行染色以提供染色物体； 洗掉多余的染料；以及密封用于保持染色物体的玻璃的边缘上的间隙，以避免染料溶液变干。5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，染色物体作为保存样本的切片布置在聚合 物中。6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，还包括将具有残留荧光的帧和包含重叠在残留荧光上的发荧光分子图像的帧保存到可记录 介质上；从包含重叠在残留荧光上的发荧光分子图像的帧中减去具有残留荧光的帧；以及 根据接收到的每个荧光分子图像的点中心坐标和强度分布的计算利用减去的帧计算 发荧光分子的位置。7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，还包括采用不同染料将物体的不同结构染成不同颜色，其中不同染料包括在不同波长下发荧光或具有不同活性基团的染料，其中不同活性基团是适于与蛋白质链接的活性基团、 适于与核酸链接的活性基团或适于链接脂肪的活性基团；采用分色镜检测在不同波长下发荧光的分子；采用分色镜和两个或多个摄像机检测在不同波长下发荧光的分子，从而可以重新构 建几种不同类型的物体分子的位置；或测定同时看到和检测到的单独的发荧光分子的数量。8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，还包括通过闪光灯、UV闪光灯、UV脉冲灯源、ATP反应、酯酶作用、过氧化反应或放射 性转化周期性将非荧光染料分子转化成发荧光染料分子。9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，还包括采用常规荧光显微术或采用具有残留荧光的帧检测染色物体中的关键颗粒，其中关 键颗粒是明亮发光的荧光颗粒、与物体刚性相连的颗粒、被引入染色物体内的颗粒；以 及采用物体内的至少一些关键颗粒计算荧光分子的坐标，考虑关键颗粒在可视区域的 运动得到达几纳米的分辨率，即使对于具有一定灵活性的物体结构的物体。10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，还包括采用分光镜和两个摄像机，它们定位成使得物体的两个相邻聚焦平面通过一个物镜 得到投影，每个荧光分子的光强度分布在通过不同摄像机检测时是不同的，利用所述不 同强度计算第三坐标以形成物体的3D图像。11.一种用于物体纳米显微的方法，包括记录充满溶液的样本的一部分内耐荧光脱色的发荧光纳米颗粒的运动，该运动允许 扫描样本的可接触的容积并显示充满液体的容积和填充有致密结构的容积；由所有帧的相应点计算纳米颗粒的位置。12.如权利要求11所述的方法，其特征在于，该方法被用于置于溶液中的物体的2D纳米显微或3D纳米显微，利用荧光显微镜、 激光器、分光镜和滤色器、...

【专利技术属性】
技术研发人员：安德烈阿莱克谢耶维奇克利莫夫，德米特里安德烈耶维奇克利莫夫，叶夫根尼安德烈耶维奇克利莫夫，塔蒂阿娜维塔利耶夫娜克利莫夫，
申请(专利权)人：安德烈阿莱克谢耶维奇克利莫夫，
类型：发明
国别省市：RU[俄罗斯]