一种能水解在合成的底物中、稳定的纤维蛋白中和其Ｄ－Ｄ－片断中的外－和内－ε－（γ－Ｇｌｕ）－Ｌｙｓ－异肽键的血栓溶解酶，其部分氨基酸序列和与其相应的基因及两个来自同一家族的附加基因的结构，并且可藉在蛋白质基本结构中的１５、２１、２４、２８、３３、４６、４９、５０位上存在甘氨酸残基来辨认。一种从医用水蛭唾液腺分泌物或含这种分泌物的制剂中制备权利要求１的血栓溶解酶的方法，对固定在固体载体上的针对天然酶的抗体进行亲合色谱处理，随后用离子交换色谱法和凝胶过滤法对酶进行提纯。（*该技术在2015年保护过期，可自由使用*）
【技术实现步骤摘要】
血栓溶解酶及其制备方法本专利技术的领域本专利技术涉及医学领域中的止血术、药理学，在临床和实验药物上用于作为血栓溶解生物活性制剂。已有文献目前对医用水蛭唾液腺分泌物的应用停留在一系列作为用于制备具有血栓溶解、纤维蛋白溶解活性的生物活性物质的各种源物质上，这些源物质仍在补充之中。对作为生物活性物质源物质的医用水蛭的天然分泌物的实际兴趣是由于在水蛭疗法的水蛭吸血法中使用医用水蛭的血栓溶解效应时，确定了由不同病因引起的血栓性静脉炎的治疗效应的依赖性(Zaitsev G.B.“血栓静脉炎”，1947，Medgiz，莫斯科，p.78)。医用水蛭唾液腺分泌物的应用是由于发现了转变为新性质的新的机理。当用酪蛋白和非稳定的纤维蛋白作为底物时，分析医用水蛭唾液腺分泌物的性能表明它几乎不具有蛋白水解活性。然而，当医用水蛭唾液腺分泌物在与交联着因子XIIIa的不溶性稳定纤维蛋白的温育过程中，纤维蛋白能转变成可溶性状态，并且纤维蛋白的稳定程度越高(即在稳定的纤维蛋白制备物中存在较多的ε-(γ-Glu)-Lys-异肽键)，转变的程度就越大。这个初看起来不合理的见解，我们解释为是由于在水蛭分泌物的组成中存在一种酶，该酶特别地水解稳定化纤维蛋白中的异肽键，而对不存在这些异肽键的非稳定化纤维蛋白不起作用。这种酶称为去稳定酶(destabilase)(Biokhimiya，50，1985，Nauka，莫斯科，pp.424-431)。已知的溶解血栓和溶解纤维蛋白的酶对纤维蛋白中肽键的水解有催化作用，与具有ε-(γ-Glu)-Lys-异肽键的“交联”纤维蛋白的程度无关，所述的异肽键是由于转肽酶、因子XIIIa的作用形成的。通常，与非稳定的纤维蛋白相比，与异肽键“交联”的或稳定化的纤维蛋白更能耐受蛋白水解酶的影响。同时，非稳定纤维蛋白能变成可溶状态，这不仅是由于纤维蛋白溶解酶刺激的蛋白水解作用的结果，也是非特异性试剂作用的结果，这些非特异性试剂会削弱纤维蛋白单体之间的离子性的、疏水性和H-O-的相互作用。本专利技术的描述本专利技术揭示了一种物质、它的性能以及制备能溶解血栓，并与按分子量和氨基酸序列从医用水蛭获得的已知制剂不同的，具有酰胺分解作用的外切异肽酶-->和内切异肽酶活性的血栓溶解酶的方法。所述制备去稳定酶的方法按下述方式进行。将医用水蛭的提取液进行亲合色谱处理，所述色谱是在含有固定在琼脂糖凝胶(sepharose)4B上针对去稳定酶的抗体柱上进行的。柱由0.02M的tris-HCl缓冲液(pH＝7.4)平衡。未交联的蛋白质用缓冲液洗涤，而去稳定酶用含0.3MNaCl的同样缓冲液洗脱。所得的制剂再次在含CM-三丙烯酸类吸着剂、用0.02Mtris-HCl缓冲液(pH＝7.4)平衡的柱上进行色谱处理。所需产物用溶解在同样0.02Mtris-HCl缓冲液中的0.05M-0.20M NaCl洗脱。收集含最终产物的组分，在Superose-12上凝胶过滤进行脱盐，冷冻干燥。结果，所得的制剂含100％的活性物质。纯度用电泳法加以确定。基本结构。为了鉴定基本结构，在含Aquapore RP-300(4.6×100)的反相柱上以0-60％的乙腈梯度，对酶进行色谱处理60分钟。确定了去稳定酶的N-末端序列。确定了苏氨酸为N-末端氨基酸。然后进行去稳定酶的溴化氰(CNBr)水解，所得的混合物再次在同样的柱上在同样的条件下进行色谱处理。结果获得了四个肽片断。确定了第一片断的氨基酸序列，它由25个氨基酸残基组成，且在NH2-末端含有苏氨酸残基：Thr Val Pro Ser Asp Cys Leu Arg Cye IleCys Gln Val Glu Gly Cys Asn Asn Glu Ile Gly Arg Cys Gly Met.对第二片断，确定了来自N-末端的，在NH2-末端为天冬氨酸的28个氨基酸序列：Asp Ala Gly Ser Leu Ser Cys Gly Pro Tyr Gln Ile Lys Glu Pro Tyr X Ile AspX Gly Arg Pro Gly Gly X Tyr Gln。对第三片断，确定了来自N-末端的，在NH2-末端为天冬氨酸的24个氨基酸残基的氨基酸序列：Asp Arg Tyr Ala Pro Pro Cys Thr Gly Gly Arg Gln Pro ThrCys Gln Asp Tyr Ala Lys Ile His Asn Met。对第四片断，确定了来自N-末端的，10个氨基酸残基的部分序列：Gly ProAsn Gly Cys Gln Ser Leu Asn Asn。甘氨酸是N-末端氨基酸。使用标准方法将m-RNA从医用水蛭中分离出来。使用逆转录在其基础上合成第一条c-DNA链。利用前一步骤获得的第一条c-DNA链和根据去稳定酶氨基酸序列选择的引物进行聚合酶链反应进行了扩增编码去稳定酶的DNA片断。结果获得了预定长度为102核苷酸对的DNA片断。按标准方法(Maniatia等人，982；Tabor，Richardson，1987)，对所得的DNA片断进行克隆和测序。测序了10个独立的克隆，结果检测到两个不同的DNA序列-DS1和DS2。DS1和DS2的核苷酸序列不同可以得出这样的结论，即在水蛭基因组中存在有对同类蛋白质进行编码的基因族。将DSl部分序列和DS2全长核苷酸序列显示如下。-->DSl核苷酸序列： 引导序列：ATG AAT TAC GTT ATC TTT GTG GTC TTA GTG GCA CTT TAC GTC 14Met Asn Tyr Val Ile Phe Val Val Leu Val Ala Leu Tyr ValATC GAC GTA GCG AAG TGC 20Ile Asp Val Ala Lys Cys结构部分：ACC GTT CCA TCC GAC TGC TTG AGT TGC ATT TGC GAG GTA GAG 34Thr Val Pro Ser Asp Cys Leu Ser Cys Ile Cys Glu Val GluGGA TGT GAC AAA GAG ATT GGA AGG TGC GGC GAT GAC GCA GGA 48Gly Cys Asp Lys Glu Ile Gly Arg Cys Gly Asp Asp Ala GlyAGT CTG AGC TGT GGT CCT... 62Ser Leu Ser Cys Gly Pro...DS2核苷酸序列： 引导序列：ATG ATC ATT GCA ATT TAT GTT TCC CTA GCT CTT CTA ATC GCC 14Met Ile Ile Ala Ile Tyr Val Ser Leu Ala Leu Leu Ile AlaTCT GTC GAG GTG AAT AGC 本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种能水解在合成的底物中、稳定的纤维蛋白中和其Ｄ－Ｄ－片断中的外－和内－ε－（γ－Ｇｌｕ）－Ｌｙｓ－异肽键的血栓溶解酶，其特征在于其部分氨基酸序列和与其相应的基因及两个来自同一家族的附加基因的结构，并且可藉在蛋白质基本结构中的１５、２１、２４、２８、３３、４６、４９、５０位上存在甘氨酸残基来辨认。２．一种从医用水蛭唾液腺分泌物或含这种分泌物的制剂中制备权利要求１的血栓溶解酶的方法，其特征在于，对固定在固体载体上的针对天然酶的抗体进行亲合色谱处理，随后用离子交换色谱法和凝胶过滤法对酶进行提纯。
【技术特征摘要】
RU 1994-12-23 940436981.一种能水解在合成的底物中、稳定的纤维蛋白中和其D-D-片断中的外-和内-ε-(γ-Glu)-Lys-异肽键的血栓溶解酶，其特征在于其部分氨基酸序列和与其相应的基因及两个来自同一家族的附加基因的结构，并且...
【专利技术属性】
技术研发人员：ED斯维尔德洛夫，IP巴斯科娃，LL萨瓦洛娃，SA卢基扬诺夫，EV巴尔索娃，EA波格丹诺娃，
申请(专利权)人：MM谢苗雅基娜及JA奥伏契宁柯娃生物有机化学学院，
类型：发明
国别省市：RU[俄罗斯]
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