本发明专利技术公开了一种能与乳链菌肽结合的突变体蛋白。本发明专利技术提供的蛋白，是如下ａ）或ｂ）的蛋白质：ａ）由序列表中序列２所示的氨基酸序列组成的蛋白质；ｂ）将序列表中序列２的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和／或缺失和／或添加且能结合乳链菌肽并且不降解乳链菌肽的由序列２衍生的蛋白质。上述蛋白的编码基因也属于本发明专利技术的保护范围之内。本发明专利技术工程菌中表达的ＮＳＲＳ２３６Ａ通过结合ｎｉｓｉｎ分子，降低了工程菌菌体表面的ｎｉｓｉｎ浓度，增强了工程菌对ｎｉｓｉｎ的抗性水平，从而使ｎｉｓｉｎ的表达量得以提高。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物
，特别涉及能与乳链菌肽结合的突变体蛋白及其编码基 因与应用。
技术介绍
乳链菌肽(nisin)是某些乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)产生的一个小肽，对 引起食品腐败和对人体健康有害的葡萄球菌、链球菌、分支杆菌、李斯特氏菌等许多革兰氏 阳性菌有强烈抑制作用，且对人体安全无毒，是一种被世界50多个国家和地区广泛应用于 罐头食品、肉制品、乳制品等领域的高效天然食品防腐剂。同时，乳链菌肽在医药和轻工等 领域也极具应用潜力。近年来，随着回归大自然的呼声日益高涨，用高效、无毒的天然防腐 剂取代传统的化学合成防腐剂是保障人类健康的迫切需要，也是世界潮流所趋，因此乳链 菌肽的生产和应用能同时产生良好的经济效益和社会效益。为能更好地推动乳链菌肽的广泛应用，进一步提高乳链菌肽产生菌的发酵效价、 提高乳链菌肽产量、降低成本等成为乳链菌肽研究者和生产者面临的重要课题。传统的菌 种诱变筛选、发酵工艺改良等手段虽能在一定程度上提高产量，但存在过程繁琐、工作量大 且成功率低等不足。而随着对乳链菌肽生物合成过程的逐步深入了解和乳酸菌基因工程手 段的完善和提高，通过基因工程的手段来提高乳链菌肽的产量在近年来已逐步引起了研究 者和生产者的关注。成熟的nisin分子由34个氨基酸组成，分子量约为3510Da。其生物 合成基因簇包含结构基因(nisA)、成熟基因(nisBTCP)、免疫基因(nisI，nisFEG)及调控基 因(nisRK)等，在核糖体上合成前乳链菌肽(prenisin)分子后，通过翻译后修饰产生羊毛 硫氨酸和β -甲基羊毛硫氨酸等稀有氨基酸，并在切除前导肽后赋予nisin分子以抑菌活 性。在了解nisin生物合成过程的基础上，目前已有尝试通过基因工程手段提高其产 量的报道。如Cheigh CI等尝试通过增加nisin生物合成中的结构基因nisZ、调控基因 nisKR以及免疫基因nisFEG的拷贝数的方法来提高乳链菌肽产量，结果发现nisZ的增加 没有效果，而nisKR及nisFEG拷贝数的增加虽在一定程度上提高了产量，但却影响了菌体 的生长速度(Cheigh et al. Biotechnology Letters (2005) 27 :155_160) ；Wu Z 等利用 Mu 转座复合体突变技术筛选出影响nisin产量的12个突变体，但没有一个能提高产量且其 中三个突变体的产量显著降低(Wu et al. Journalof Applied Microbiology (2009) 106 41-48) ；Kim W等利用转入包含免疫基因nisi的60kb大质粒，获得了一定的提高产量 的结果(Kim W et al. Applied MicrobiologyBiotechnology(1998) 50 429-433) 后 期研究结果发现，NisI蛋白在体外与nisin结合能提高其活性(Koponen 0 et al. FEMS Microbiology Letters (2004) 231 :85_90)；定位于产生菌细胞膜上的NisI蛋白表达量 的增加可结合更多的nisin分子，从而提高了产生菌自身抵抗nisin的能力，使得nisin产 量也得以提高。由上可见，利用nisin产生菌中的免疫蛋白NisI与nisin分子结合的特性， 在细胞表面阻止nisin对自身菌体的破坏，增强菌体对nisin的抗性，是提高nisin产量的一条可行途径。在一些不产生nisin却对nisin有天然抗性的菌株中，是不含有NisI免疫蛋白 的，其对nisin的抗性是由nisin抗性基因(nisin resistance gene, nsr)编码的一个分 子量约为35kDa的nisin抗性蛋白(nisin resistance protein，NSR)决定的。汤莎等 从新鲜牛奶样品中分离得到一株不产nisin但具nisin抗性的乳酸乳球菌菌株L. Iactis TS1640,经抗性检测、PCR扩增和DNA序列测定等证明其含有nisin抗性基因nsr，该基因 编码318aa的NSR(汤莎等，微生物学报(2001) 41 :536 541)。NSR蛋白C末端存在一个 保守的末端特异性蛋白酶结构域，体内体外研究结果表明NSR能行使蛋白酶功能，特异性 地从nisin分子的C末端降解nisin，使其抑菌活性大大降低，从而行使乳链菌肽抗性功能 (Sun Z et al. Antimicrobial Agents andChemotherapy(2009)53 1964-1973)
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种能与乳链菌肽结合的突变体蛋白。本专利技术提供的蛋白，是如下a)或b)的蛋白质a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；b)将序列表中序列2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失 和/或添加且能结合乳链菌肽并且不降解乳链菌肽的由序列2衍生的蛋白质。上述蛋白的编码基因也属于本专利技术的保护范围之内。上述的编码基因，是如下1)或2)或3)的基因1)其编码序列是序列表中序列1自5’端的第186位到第1139位所示的基因；2)在严谨条件下与1)限定的基因杂交且编码上述的蛋白的基因；3)与1)限定的基因具有90%以上的同源性且编码上述蛋白的基因。上述编码基因可具体为序列表中序列1所示。上述严谨条件可为在6 X SSC, 0. 5 % SDS的溶液中，在65°C下杂交，然后用2 X SSC, 0. 1 % SDS 和 1 X SSC, 0. 1 % SDS 各洗膜一次。含有上述的编码基因的重组载体也属于本专利技术的保护范围之内。上述重组载体中的启动上述的编码基因转录的启动子是乳酸菌组成型强启动子； 所述乳酸菌组成型强启动子为P59。所述重组载体是将P59和上述的编码基因导入pHJ201的多克隆位点中，得到的重 组表达载体。上述P59的序列如序列1的自5，端第1-185位所示。上述载体pHJ201构建方法用EcoRI和HindIII酶切pMG36e质粒(购自荷兰NIZO 研究所)，回收大片段，将nisZ前体基因(包含启动子，序列如序列表中序列4所示)的片 段同样用EcoRI和HindII酶切，与回收的pMG36e的大片段相连，得到载体pHJ201。含有上述基因的重组菌或转基因细胞系也属于本专利技术的保护范围之内。上述重组菌是将任一上述的重组载体导入乳酸菌中，得到重组乳酸菌；所述乳酸 菌优选是 L. Iactis NZ9800。本专利技术的另一目的在于提供一种生产乳链菌肽的方法，是将上述的重组菌经过发 酵培养，获得乳链菌肽。上述发酵培养的条件是以1 100转接培养过夜的乳酸菌于含红霉素为5ug/ml 的GM17 (胰蛋白胨0. 5%，大豆蛋白胨0. 5%，牛肉浸膏0. 5%，酵母提取物0.25%，葡萄糖 0.5%，维生素C 0. 05%, β-甘油磷酸钠1.9%，硫酸镁lmmol/L)培养基中于30°C静置培养。本专利技术的原理是对乳链菌肽抗性蛋白NSR保守结构域的分析，其Ser236在所有末 端特异性蛋白酶中均保守，是其可能的活性中心，因此将236位丝氨酸突变为丙氨酸能使 其丧失对nisin的降解作用。本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种蛋白，是如下（ａ）或（ｂ）的蛋白质：（ａ）由序列表中序列２所示的氨基酸序列组成的蛋白质；（ｂ）将序列表中序列２的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和／或缺失和／或添加且能结合乳链菌肽并且不降解乳链菌肽的由序列２衍生的蛋白质。
【技术特征摘要】
1.一种蛋白，是如下(a)或(b)的蛋白质(a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列表中序列2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和 /或添加且能结合乳链菌肽并且不降解乳链菌肽的由序列2衍生的蛋白质。2.权利要求1所述蛋白的编码基因。3.根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于所述编码基因是如下1)或2)或3) 的基因1)其编码序列是序列表中序列1自5’端的第186位到第1139位所示的基因；2)在严谨条件下与1)限定的基因杂交且编码权利要求1所述的蛋白的基因；3)与1)限定的基因具有90%以上的同源性且编码权利要求1所述蛋白的基因。4.含有权利要求2或3所述的编码基因的重组载体。5.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于所述重组载...
【专利技术属性】
技术研发人员：钟瑾，胡红梅，孙志增，刘家乐，还连栋，
申请(专利权)人：中国科学院微生物研究所，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]
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