应用氟吡氨酯预防和治疗与造血细胞系统损伤有关的疾病技术方案

活性化合物氟吡氨酯或其药学上适用的盐在制备一种治疗与造血细胞系统损伤有关的疾病的药物中的应用。（*该技术在2016年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及氟吡氨酯(flupirtine)或它的盐类作为药物在预防和治疗与造血细胞系统(例如淋巴细胞)损伤有关的疾病中的应用。氟吡氨酯是一种已知的、明确的非阿片类镇痛剂，通过中枢神经系统发挥作用。氟吡氨酯表现出的镇痛作用机制与阿片剂/类阿片镇痛剂不同〔Nickel，B.，《医学研究生杂志》(Postgrad Med J)，63期(增刊第3号)，19页(1987年)；Szelenyi，I.，Nickel，B.，Borke，H.O.，Brune K.，《英国药理学杂志》(Br.J.Pharmacol)，143期，89页(1989年)〕。电生理研究表明，氟吡氨酯能够在脊髓和脊髓上水平影响感受伤害活动〔Carisson，K.H.，Jurna，I.，《欧洲药理学杂志》(Eur.J.Pharmakol)，143期，89页(1987年)；Bleyer，H.，Carlsson，K.H.，Erkel，H.J.，Jurna，I.，《欧洲药理学杂志》151期，259页(1988年)；Nickel，B.，Aledter，A.，《医学研究生杂志》，63期(增刊第3号)，41页(1987年)〕。氟吡氨酯还可以用于运动系统疾病导致的急性疼痛期间的治疗。进一步，氟吡氨酯还成功地治疗了变性或风湿性疾病。除了良好的镇痛作用，氟吡氨酯还具有松驰肌肉的特性。因此它也用于治疗肌肉紧张，或由肌肉紧张导致的疾病(DE 40 22 442)。在研究氟吡氨酯对大鼠的肌松作用过程中，进一步发现兴奋性氨基酸N-甲基-D-天冬氨酸(NMDR)能够抑制氟吡氨酯的作用。由于这种NMDR拮抗作用，氟吡氨酯也适于治疗一些由NMDR介导的中枢神经系统疾病，例如脑缺血、神经变性疾病和癫痫发作(DE 43 27516)。氟吡氨酯的化学名称是2-氨基-3-乙氧羰基氨基-6-(对氟苄基氨基)吡啶。氟吡氨酯和其药学适用盐类的合成方法已由专利DE 1795 858、DE 31 33 519和DE 34 16 609说明。令人惊奇地是，现在发现氟吡氨酯能够抑制造血系统(例如淋巴细胞)细胞的细胞凋亡。这一发现有希望打开用氟吡氨酯治疗一些与造血细胞系统损伤有关的疾病的希望，特别重要之处是治疗HIV感染患者/艾滋病人。本专利技术将通过药理学研究阐述氟吡氨酯的新作用。药理学研究材料马来酸氟吡氨酯〔2-氨基-3-乙氧羰氨基-6-(对氟苄基氨基)吡啶马来酸盐〕，用HIV-1病毒株HTLVIIIB制备的HIV-1-gp120(Popovic等，1984年)。通过聚丙烯酰胺凝胶电泳显示，制备的gp120制备物纯度大于95％〔Muller等，1988年〕。抗逆转录病毒分析HIV-1病毒的分析方法已有报道〔Sarin等，1987年〕。人T-淋巴母细胞系CEM(接种浓度1×105个细胞/ml)的细胞悬浮在培养基中并用HIV-1病毒(HTLVIIIB株)感染，选择一个50％细胞培养感染剂量〔CCID50〕的50倍作为实验中所用的感染量。一个CCID50指悬浮细胞中每毫升细胞的50％被感染所用的感染剂量。1毫升培养液孵育5天。在感染前2小时把不同浓度的氟吡氨酯加至细胞中。通过3-〔4，5-二甲基噻唑-2-基〕-2，5-二苯四唑溴〔MTT〕比色分析法计算活细胞的数目〔Scudiero等，1988年〕，也可以用不久前分布的方法，通过ELISA读数仪测定〔Muller等，1991年〕。孵育后，未感染的CEM细胞进行2.16个，而感染的细胞则进行0.13个细胞分裂周期。血液样本人外周血的样本采自(i)12个HIV-1感染的男性同性恋者〔平均年龄35岁；年龄范围22-43岁〕，(ii)8个健康的HIV-1血清学阴性的男性，但与上组患者年龄相近，有同样患病的危险因素〔平均年龄30岁；年龄范围23-35岁〕。根据美国疾病控制中心(CDC，1992年)的分类标准将患者分类。用HIV-1血清学阳性的患者与无症状的病毒携带者的血样进行研究(美国疾病控制中心标准A1，A2意味着CD4细胞数是407个/μl，范围209-698个/μl)。病史中无一例患者出现过肿瘤、有症状的感染，或者在采集血样10周前曾经接受过免疫抑制剂，例如可的松的治疗。细胞制备及其处理用Ficoll-Hypaque密度梯度液离心肝素化的血液，从中分离出单核细胞(MNC)并且浓缩〔Rossol等，1990年〕。0.5×106个细胞置于终容量为500μl的培养基中，所用的培养基是MEM-培养基，内含10mM HEPES缓冲液、2.6％碳酸氢钠、100单位/L青霉素、100μg/ml链霉素、10％胎牛血清(FCS)和1mM谷氨酸。需强调的是，分离之后要用化学物质立刻处理细胞。用反应活性氧诱导细胞调亡通过次黄嘌呤〔HX〕和黄嘌呤氧化酶〔XOD〕系统产生反应活性氧基〔Bruck等，1994年〕。单核细胞在总容量为500μl的MEM培养基中悬浮24小时(如上描述)。0-80mU/ml的黄嘌呤氧化酶和1mM次黄嘌呤加入这份细胞中。黄嘌呤氧化酶(Sigma公司，德国慕尼黑)浓度为90mU/ml时，90％以上的淋巴细胞出现凋亡。除非特别地指出，下列试验中用的是10mU/ml黄嘌呤氧化酶和1mM次黄嘌呤。在这样的孵育条件下，大约50％的细胞出现凋亡。当检查某种化合物是否是一种潜在的细胞凋亡的抑制剂和/或刺激剂时，最好能保持这个50％的细胞凋亡比率。氟吡氨酯加主细胞中之前6小时加入产生氧基的系统，孵育1天后中止反应。连续流式细胞仪做细胞分析根据已经发表的方法(Schmid等，1994年)，用FACScan(Becton-Dickinson产品)连续流式细胞仪分析细胞的凋亡，细胞仪以488nm波长的氩激光激发。通过光学方法，结合前光散射检查细胞的大小〔FSC〕和垂直散射光检查细胞表面的成分〔SSC〕，来区分并且确定淋巴细胞。为了染色凋亡的单核细胞，要把这些细胞孵育在含20μg/ml的7-氨基放线菌素D(7-AAD)(Sigma产品)的PBS溶液中，置4℃黑暗中20分钟。然后，在染液中用连续流式细胞仪分析细胞。用650nm波长的滤过器检查7-氨基放线菌素D发出的红色荧光。由于细胞膜的裂解，7-氨基放线菌素D穿透凋亡的细胞，通过插入过程进-步将DNA染色。用LYSIS II程序分析数据。均道数转化成平均荧光强度、细胞大小和表面组成成分。用TdT法和表面标记进行原位荧光标记为了明确某一细胞亚群正在发生细胞的凋亡，以末端转移酶系统(TdT)处理细胞，应用Gorczyca等(1993年)的方法并稍做改进。悬浮细胞用PBS(Gibco产品)冲洗二次，然后用1％强度的多聚甲醛(Riedel de Haen产品)4℃下固定10分钟。用PBS液(已加入5％AB血清和0.5％牛血清白蛋白)冲洗二次后，将细胞沉集，并重新悬浮于加了0.5nM生物素-16-dUTP和25U末端转移酶系统的50μl的2.5mM氯化钴溶液中，再加入200mM卡可酸钾、25mM Tris-HCl和0.25mg/ml牛血清白蛋白成为缓冲液。根据制造商的用户指南(Boehringer Mannheim，Mannheim，FRG)，37℃下孵育30分钟。然后用PBS缓冲液(内含5％AB血清和0.5％牛血清白蛋白)冲本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】

【专利技术属性】
技术研发人员：G·伯甘德，W·E·G·米勒，
申请(专利权)人：维亚特里斯两合公司，
类型：发明
国别省市：