霍乱弧菌口服活菌苗制造技术

本发明专利技术提供了两株可用于人霍乱病防治的口服活菌苗候选株，其特征在于首先选育出ｔｈｙＡ基因缺陷的零乱弧菌ＩＥＭ１０１受体菌株，进而构建以ｔｈｙＡ基因为选择压力的霍乱弧菌染色体－质粒致死平衡系统，再应用该系统构建了霍乱弧菌抗菌抗毒口服活菌苗候选株，它们能表达霍乱弧菌菌体Ｏ抗原和毒素抗原，在兔肠段结扎模型上有较好的安全性、免疫原性和保护力。（*该技术在2019年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种霍乱工程菌复合苗的制备和应用。霍乱是由定居在小肠的非侵袭性霍乱弧菌引起的烈性肠道传染病，传播快、波及面广、危害严重。自1883年Koch分离到霍乱病原菌——霍乱弧菌以来，人们就开始了霍乱免疫预防的研究，至今已百余年，尚无理想的霍乱菌苗问世。全细胞死菌苗的保护率仅约为50％，保护持续时间短(约半年)且要多次口服，至今未被世界卫生组织认可。早期人们筛选的天然减毒株和化学方法诱变的减毒株，或因免疫效力低下，或因突变位点不明、理论上可发生回复突变以及由于毒素基因的缺失而无抗毒保护等缺陷未被接受。随着分子生物学技术的发展，近年来各国学者采用基因重组技术，相继研制了多种菌苗候选株，归纳起来主要有两大类。一类是加法苗，但遗憾的是此类菌苗由于尚无合适的肠道受体菌，从而不能产生有效的保护；第二类是减法苗，在这一类中最为突出的例子是美国菌苗发展中心(CVD)研制的CVD系列菌苗株；但到目前为止，所构建的此类菌苗仍有部分残留毒性，使其应用受到一定限制。以抗生素抗性为选择压力的基因表达系统存在着(1)．质粒的稳定性依赖于抗生素选择性压力的持续存在；(2)．含抗生素抗性质粒的菌苗用于人或动物，有可能造成抗性的扩散，给临床治疗带来困难等缺陷。另外，将外源基因整合到宿主菌染色体上，在体外可以稳定地保留并表达外源基因，虽然可解决和避免以抗生素抗性作为稳定因子的质粒稳定性问题，但该系统基因的表达水平明显低于以质粒作为载体的克隆子，其刺激机体免疫应答的能力也明显低于后者。至今，还无一种商品化的霍乱菌苗问世。霍乱的免疫特征为以抗菌免疫为主，抗菌与抗毒免疫协同作用，刺激肠道局部产生分泌性IgA抗体。早在六十年代，人们就认识到CT(霍乱肠毒素)是霍乱弧菌致泻的主要毒力因素。CT是一种活性多聚体蛋白，由有腺苷酸转移酶活性的A亚单位及5个相同的与肠上皮细胞上的神经节苷脂受体GM1结合的B亚单位非共价结合而成。CT的毒性作用与免疫原性在构建霍乱菌苗时是相互矛盾的两个方面，意大利Biocine公司应用蛋白质工程技术，通过寡核苷酸介导的定位突变，将ctx基因的第63位丝氨酸突变成赖氨酸，使CT蛋白构象改变，而变为无毒的霍乱肠毒素(CT*)，但仍可表达并分泌完整的CT*毒素蛋白，并可与GM1受体及抗A和抗B亚单位的单抗结合。IEM101是本室筛选出的一株无毒的ctx(霍乱肠毒素基因)基因天然缺失的EVC(埃尔托霍乱弧菌)菌株，动物实验有较好的保护力，人体志愿者一次口服免疫，在人体可定居4-9天，并能刺激机体产生血清和肠道局部特异性保护抗体，无明显毒副作用，为理想的菌苗候选株。但该菌株由于缺少ctx基因，免疫机体后只产生抗菌免疫，不产生抗毒免疫。本专利技术的目的是首先选育出霍乱弧菌IEM101菌株的thyA(胸苷酸合成酶基因)基因缺陷受体菌株，进而应用以thyA基因为选择压力的染色体——质粒致死平衡系统，将无毒的CT*毒素基因ctx*(含有点突变的霍乱肠毒素基因)和ct-B(霍乱肠毒素B亚单位基因)基因分别引入，构建成能表达CT*或CT-B(霍乱肠毒素B亚单位)的霍乱弧菌抗菌抗毒口服活菌苗，并通过家兔主动保护试验评价它们的免疫原性及主动保护力，为霍乱病的防治提供口服活菌苗候选株。本专利技术的菌株已于1998年12月16日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号CGMCC NO.0377.1和CGMCC NO.0377.2。本专利技术的内容与要点本专利技术包括霍乱弧菌菌株、其生产方法及其使用方法。所说的霍乱弧菌菌株不仅可用作廉价表达系统，批量生产多肽、蛋白质、细胞因子等生物活性物质，还可用作口服活菌苗菌株。一．thyA基因缺陷的霍乱弧菌IEM101菌株的选育。菌苗的起始材料是天然无毒的O1群霍乱弧菌IEM101菌株(中国预防医学科学院流行病学微生物学研究所保存)。本专利技术在改良MM基本培养基的基础上，选育出一株生长良好且生物学性状稳定的霍乱弧菌IEM101菌株的thyA基因缺陷株PL102，作为下一步实验的受体菌株。二．霍乱弧菌以thyA基因为选择压力的染色体——质粒致死平衡系统的构建(图4)。本专利技术用PCR(聚合酶链反应)扩增大肠杆菌的thyA基因，PCR产物经地高辛标记后作为探针与IEM101的染色体DNA进行同源性分析，进而将该PCR产物克隆到质粒载体pUC18上，再转化到PL102菌株中，获得含有pXXB106质粒的转化子，并进行质粒稳定性试验。三．霍乱弧菌抗菌抗毒口服活菌苗的构建(图8、10)。质粒CT-K63经限制性内切酶切后，回收携带有ctx*基因的目的片段，平端连入pUC18载体，再将大肠杆菌的thyA基因连入该重组质粒后，经限制性内切酶切去部分Ap(氨苄青霉素)基因片段，导入PL102中构建成含全ctx*基因的菌苗候选株。根据已报道的ctx基因序列设计一对引物扩增ct-B基因，将PCR产物克隆到pUC18载体上，再将大肠杆菌的thyA基因连入该重组质粒后，经限制性内切酶切去除部分Ap基因片段，导入PL102中，构建成仅含ct-B基因的菌苗候选株。四．本专利技术中菌株的特征1．IEM104和IEM105的生物学性状(1)血清型霍乱弧菌EVC小川型。(2)生化反应发酵葡萄糖、蔗糖、半乳糖、麦芽糖、左旋糖、甘露醇、甘露糖、糊精和可溶性淀粉，产酸不产气；不发酵木胶糖、水杨素、肌醇、卫茅醇、阿拉伯糖；溶血试验阳性。(3)噬菌体-生物型1a.2．GM-ELISA检测ctx*和ct-B基因的表达无论是培养上清液还是细胞裂解物，均以20倍浓缩后测定CT*或CT-B的表达和分泌。阳性对照为霍乱弧菌高产毒株569B的20倍浓缩液，阴性对照为大肠杆菌DH5α的20倍浓缩细胞裂解物。P/N≥2.0为阳性。表1CT*和CT-B表达的GM1-ELISA检测 注诱导为在培养物中加入IPTG诱导重组子中目的基因的表达。569B为阳性对照，DH5α为阴性对照。P/N≥2.0为阳性，P/N＜2.0为阴性。3．毒力测定家兔小肠结扎测毒将IEM104和IEM105菌分别接种于5ml产毒培养基中，37℃静止培养48小时后，离心收集菌沉淀，用生理盐水稀释到108CFU，取1ml肠内注射，结果IEM104和IEM105的肠段积液量均为0ml/cm(大于1.0ml/cm为阳性)。4．IEM104和IEM105在家兔的免疫原性检测IEM101、IEM104和IEM105分别免疫家兔后不同时期检测PBL(外周血淋巴细胞)分泌抗CT-IgG、血清抗CT-IgG、血清杀弧菌抗体滴度和血清凝集抗体滴度，结果见表2、3、4、5。表2免疫后不同时期PBL分泌抗CT-IgG ELISA检测结果 注以上数值为各组P/N平均值，P/N≥2.0为阳性，P/N＜2.0为阴性。表3免疫后不同时期血清抗CT-IgG ELISA检测结果 注以上数值为各组P/N平均值，P/N≥2.0为阳性，P/N＜2.0为阴性。表4免疫后不同时期血清杀弧菌抗体滴度 注表中数值为各组抗体滴度的平均值(1)<p>实施例8 实施例9 实施例10 >IEM101、IEM104和IEM105经家兔肠道免疫28天后，用EVC吴江-2(稻叶)，滨-43(小川)和CVC(古典型霍乱弧菌)1119(稻叶)、39本文档来自技高网...

【技术保护点】
霍乱弧菌口服活菌苗，其特征在于首先选育出ｔｈｙＡ基因缺陷的霍乱弧菌受体菌株，然后构建以ｔｈｙＡ基因为选择压力的霍乱弧菌染色体－质粒致死平衡系统，再将无毒的ＣＴ↑［＊］毒素基因ｃｔｘ↑［＊］和ｃｔ－Ｂ基因分别引入，构建成能表达ＣＴ↑［＊］或ＣＴ－Ｂ的霍乱弧菌抗菌抗毒口服活菌苗。

【技术特征摘要】
1．霍乱弧菌口服活菌苗，其特征在于首先选育出thyA基因缺陷的霍乱弧菌受体菌株，然后构建以thyA基因为选择压力的霍乱弧菌染色体——质粒致死平衡系统，再将无毒的CT*毒素基因ctx*和ct-B基因分别引入，构建成能表达CT*或CT-B的霍乱弧菌抗菌抗毒口服活菌苗。2．按照权利要求1所述的霍乱弧菌口服活菌苗，其特征是在含有胸腺嘧啶核苷和TMP的MM改良培养基上，选育出霍乱弧菌IEM101菌株的thyA基因缺陷株。3．按照权利要求1所述的霍乱弧菌口服活菌苗，其特征是用PCR方法获得大肠杆菌的thyA基因。4．按照权利要求3所述的霍乱弧菌口服活菌苗，其特征是将上述PCR产物与质粒载体pUC18连接，然后转化thyA基因缺陷的霍乱弧菌IEM101菌株，获得含有pXXB106质粒的转化子。5．按照权利要求1所述的霍乱弧菌...

【专利技术属性】
技术研发人员：祁国明，夏晓滨，刘延清，
申请(专利权)人：中国预防医学科学院流行病学微生物学研究所，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]