抗腹泻的口服疫苗制造技术

本发明专利技术公开了一种抗肠产毒性大肠杆菌引起的人腹泻的口服疫苗组合物。它含有确定量的至少三种不同类型的移生因子抗原（ＣＦＡｓ），例如每一类型１００－３００μｇ，该抗原选自ＣＦＡⅠ、ＣＦＡⅡ（ＣＳ１、ＣＳ２和ＣＳ３）和ＣＦＡⅣ（ＣＳ４、ＣＳ５和ＣＳ６），与确定量的Ｂ亚基霍乱毒素（ＣＴＢ），例如０．５－２．０ｍｇ，一起存在于缺乏编码热不稳定性肠毒素（ＬＴ↑［－］）基因的死大肠杆菌中，还含有一种载体，例如ＰＢＳ。该疫苗组合物是从可能存在的热稳定性肠毒素（ＳＴ）中纯化的。（*该技术在2019年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种抗腹泻口服疫苗。更淮确地说，是涉及一种抑制引起人腹泻的肠产毒性大肠杆菌的口服疫苗组合物。背景细菌和病毒通常在其膜上或膜内表达，特定环境中的蛋白质起到载体的作用，使生物体以特定方式联系或依附表面。这种表面可以是人或动物体的胃肠道的内壁、食道、或任何其它生物表面或者膜，生物体在这些地方可找到最适宜的生长环境。通常称这种微生物膜蛋白为移生因子抗原(CFA)或菌毛。文献中，这种物质也用其它词例如伞毛蛋白、血凝素蛋白、丝状蛋白或纤维蛋白表示。为方便起见，本文中用的“CFA”包括所有这类也可具有抗原特性的膜蛋白。对于大多数生物体，其CFA的产生受到环境中的各种因素控制，而它们也可以激活质粒DNA中的调节基因。许多与医学有关的细菌已被证实可产生与其膜相关的CFA。在这些细菌中，对于人来说最重要的是定居在人的胃肠道和呼吸道的生物体。定居在胃肠道的生物体例如有肠产毒性大肠杆菌、霍乱弧菌、弯曲菌属、幽门螺旋菌、志贺菌属、沙门菌属和耶尔森菌属。其中医学上特别有用的是肠产毒性大肠杆菌(ETEC)，因为它是旅行者腹泻和发展中国家儿童腹泻的一个主要诱因，每年多于十亿人出现腹泻且至少有一百万人死亡，主要是儿童。肠产毒性大肠杆菌的特性是可产生热不稳定性肠毒素(LT)和/或热稳定性肠毒素(ST)。在WO 92/14487中，公开了口服ETEC疫苗的制备方法和用途。带有CFA的ETEC细菌及其亚成分(CS-抗原)在特定条件下生长。然后可将随后被福尔马林杀死的细菌作为一种抑制ETEC细菌的口服疫苗。因此CFA和CS抗原在肠道发生的免疫过程中起到抗原的作用。要有规模地生产带有CFA的ETEC细菌目前还存在困难，此问题在国际专利申请WO 95/33825中公开了一种解决方案。ETEC疫苗的制剂包含B亚基霍乱毒素，它在抗原上与ETEC的热不稳定性肠毒素相似，还包含ETEC的移生因子抗原，已经证实这种疫苗制剂可刺激瑞典志愿者的相关粘膜的免疫应答(Jerborn M.，等，《疫苗》1997；16255-260)。为了产品安全且有效，疫苗组合物必须是非感染性的、且含有确定量的每批都相同的活性成分。专利技术的说明本专利技术提供了一种新的疫苗组合物，它基于阴性LT致死肠产毒性大肠杆菌，含有确定量的至少三种不同类型的移生因子抗原，和在抗原上与ETEC的热不稳定性肠毒素相似的B亚基霍乱毒素(CTB)。而且，该疫苗组合物是从可能存在的热稳定性肠毒素(ST)中纯化的。LT阴性的ETEC细菌可以在实验室从天然基因修饰菌株中选择或通过重组技术制备。可能存在的热稳定性肠毒素是19个氨基酸残基的一种较小的蛋白质，在疫苗组合物的下游处理过程中被中洗掉了。消除细菌产生热不稳定性肠毒素的可能性和去除可能存在的热稳定性肠毒素可使产品安全。杀死细菌应该以基本上保留移生因子抗原的方法进行，例如用温和的福尔马林失活的方法。因此，本专利技术提供了一种抗引起人腹泻的肠产毒性大肠杆菌的口服疫苗组合物，它含有确定量的至少三种不同类型的移生因子抗原(CFAs)，该抗原选自CFA I、CFA II(CS1、CS2和CS3)和CFA IV(CS4、CS5和CS6)，与确定量的B亚基霍乱毒素(CTB)一起存在于缺乏编码热不稳定性肠毒素(LT-)基因的死大肠杆菌中，还含有一种载体，该疫苗组合物是从可能存在的热稳定性肠毒素(ST)中纯化的。在本专利技术口服疫苗的一个实施方式中，确定量的不同类型的CFA是指每一类型至少100μg，确定量的CTB是至少0.5mg，载体为生理学上可接受的缓冲溶液。在一个优选实施方式中，确定量的不同类型CFA是指每一类型CFA为100-300μg，CTB的确定量为0.5-2.0mg。在本专利技术的最优选的实施方式中，确定量的不同类型CFA是指200μg CFA/I、200μg CS1、150μg CS2、200μg CS4和CS5 150μg CS5，以及CTB为1.0mg，生理学上可接受的缓中溶液是磷酸缓中盐水溶液。本专利技术疫苗组合物的剂量包含约1011细菌。该疫苗组合物以溶解在一杯水中的口服形式对人给药，水中含有碳酸盐缓冲剂，例如碳酸氢钠。实验不同移生因子抗原用量的确定通过抑制ELISA检测大肠杆菌菌毛抗原，该方法基本上如Lopez-Vidal Y.，等的《临床微生物学杂志》vol 26，1967-1972(1988)所述。简言之，将所要分析的细菌样品与固定量的直接抗CFA的单克隆抗体一起培养。培养后，将混合物转移至预先铺有CFA的平板上，其中剩余的单克隆抗体可与CFA结合。通过加入辣根过氧化物酶缀合抗鼠免疫球蛋白使结合的抗体显色。作为底物使用的是柠檬酸盐缓冲剂中的邻苯二胺二盐酸。在与装有数据压缩软件的计算机相连的分光光度计中于450nm测定光密度。所观察到的光密度与样品中抗体的浓度成反比。疫苗组合物的配制配制的许多口服ETEC疫苗分别是从福尔马林致死的CFA/I SBL菌株101、CS1 SBL菌株106、CS2 SBL菌株107、CS4 SBL菌株104、CS5SBL菌株105的几种单价体疫苗、以及纯化的rCTB的一种单价体疫苗衍生的。组合物 菌株SBL-104和SBL-105也产生CS6，但其数量还不确定。菌株SBL-107也产生CS3，但其数量还不确定。评价本专利技术抗旅行者腹泻的口服ETEC B亚基致死全细胞疫苗的效能和反应原性的试验研究在双盲、随机、安慰剂的对比试验研究中，对三组澳大利亚旅行者进行了调查研究。除了ETEC疫苗，还包括口服B亚基全细胞霍乱疫苗，因为以前已证实在孟加拉国(Clemens J.，等，《感染性疾病杂志》1988，158372-377)和去摩洛哥的法国的旅行者(Peltola H.，等Lancet，1991，3381285-89)中对大肠杆菌LT-腹泻具有明显的抑制。总共包括250名志愿者，成人和儿童，它们签约参加了为期7-23天的热带或亚热带之旅(非洲、亚洲和拉丁美洲的44个不同国家)。其中12人由于违反协议而被撤出了，这样，要治疗的人群为238人，每种方案完全满足要求的人群为187人。在出发前7-21天期间，不少于7天且不多于30天，给两种连续剂量的疫苗或安慰剂。给两种剂量后，记录接种疫苗后的症状和副作用。对所有在该研究中已注册的志愿者均备有每天记录日记、以监测旅游者在国外期间所出现的腹泻，且备有收集腹泻时的大便样品的运载介质(Portagerm和Cary Blair管)。返回后让旅游者立即移交他们的旅行日记和运载介质管。从第一次和第二次给疫苗或安慰剂前后的73名志愿者中取出用于测试免疫原性的血样。第一次给药后，在使用第二次剂量之前，立即收集样品，返回后抽取第二次给药后的血样。给三组随机旅行者所用的制剂为ETEC疫苗，包含1mg重组B亚基霍乱毒素和1011福尔马林致死的、表达最普通的移生因子抗原(CFA)的5种ETEC菌株的ETEC细菌，例如CFA I、CFA II(CSl、CS2和CS3)和CFA IV(CS4、CS5和CS6)；B亚基霍乱全细胞疫苗(自1992年在瑞典注册)，它包含1mg重组B亚基霍乱毒素和1011致死全细胞(Inaba、Ogawa、classical和E1 Tor)；安慰剂含1011致死大肠杆菌K12。将这些本文档来自技高网...

【技术保护点】
抗引起人腹泻的肠产毒性大肠杆菌的口服疫苗组合物，它含有确定量的至少三种不同类型的移生因子抗原（ＣＦＡｓ），该抗原选自ＣＦＡⅠ、ＣＦＡⅡ（ＣＳ１、ＣＳ２和ＣＳ３）和ＣＦＡⅣ（ＣＳ４、ＣＳ５和ＣＳ６），与确定量的Ｂ亚基霍乱毒素（ＣＴＢ）一起存在于缺乏编码热不稳定肠毒素（ＬＴ↑［－］）基因的死大肠杆菌中，还含有一种载体，该疫苗组合物是从可能存在的热稳定性肠毒素（ＳＴ）中纯化的。

【技术特征摘要】
SE 1998-12-18 9804415-91.抗引起人腹泻的肠产毒性大肠杆菌的口服疫苗组合物，它含有确定量的至少三种不同类型的移生因子抗原(CFAs)，该抗原选自CFA I、CFAII(CS1、CS2和CS3)和CFA IV(CS4、CS5和CS6)，与确定量的B亚基霍乱毒素(CTB)一起存在于缺乏编码热不稳定肠毒素(LT-)基因的死大肠杆菌中，还含有一种载体，该疫苗组合物是从可能存在的热稳定性肠毒素(ST)中纯化的。2.根据权利要求1所述的口服疫苗，其...

【专利技术属性】
技术研发人员：尼尔斯卡林，珀阿斯克洛夫，乌尔夫比埃尔，
申请(专利权)人：SBL瓦辛公司，
类型：发明
国别省市：SE[瑞典]