增强植物对感染的抵抗力的方法技术

本发明专利技术涉及在植物中产生能赋予对外伤的抵抗力的蛋白质的表达系统。所述表达系统用于修饰植物以增强它们对感染和创伤的抵抗力。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及能增强植物对感染，包括病原体和创伤所致感染的抵抗力的蛋 白质。本专利技术还涉及通过表达编码这些蛋白质的基因来增强植物对感染抵抗力 的方法。
技术介绍
预先形成的和诱导的防御机理为植物宿主对遇到的许多病原体提供广谱抵抗力。病原体特异性的防御反应通常由宿主的相应抗性(R)蛋白识别病原体 无毒力(Avr)蛋白来启动。最后，植物宿主会产生一系列防御分子(包括发病机 理相关蛋白质)来限制或杀伤病原体。抵抗力启动和抗性蛋白质产生之间的过 程涉及尚未完全阐明的复杂信号转导网络。通过分子遗传学方法鉴定已在拟南芥04ra&Wo/w" Aa/Zawa)中鉴定了防御 信号转导网络的许多重要节点(hub)，包括EDS1 (增强疾病易感蛋白41 (Enhanced Disease Susceptibility l)) 、 NPR1 (PR基因的非表达体 l(Non-Expresser of PR Genes l))和NDR1 (非物种特异性疾病抵抗力蛋白 l(Non Race-Specific Disease Resistance l))。采用相似的策略以及生物化学 研究，确认了拟南芥中植物激素信号参与防御反应，特别是水杨酸(SA)，以 及其它植物激素，例如茉莉酸(JA)和乙烯(ET)的作用。植物防御反应中采用许多已知的信号传导策略。例如， 一些R蛋白是受 体激酶，而其它蛋白激酶也起重要作用。生物化学信号，例如钙流(calcium flux) 和氧化爆发也是重要的。此外，有几篇报道称其它信号传导组分，例如G-蛋 白和RING(真正感兴趣的新基因(区eally Interesting New Qene))锌指蛋白参与 其中。RING锌指蛋白是具有高度保守性锌结合区的一组多样性蛋白。根据半胱 氨酸(C)和组氨酸(H)残基组合的类型，RING锌指蛋白区可分成标准的和修饰 的RING锌指。标准的RING锌指可以再分成两个亚类HC亚类(共有 C-X2-C-X9.39-C-Xu3-H-X2.3-C-X2-C-X4-48-C-X2-C) (SEQ ID NO:l)和H2亚类 (共有C-XrC-XgwC-Xw-H-Xw-H-XrC-Xws-C-XrC) (SEQ ID NO:2) (Stone, S. L.等，尸/a"f尸/z"/o/ogy (2005) 137:13-30)。修饰的RING锌指包括 RING-C2、 RING-v、 RING-D、画G陽S/T和RING匿G。RING锌指蛋白家族(包括HC和H2亚类)的许多成员是E3泛素连接酶。 不同亚类的RING锌指区决定了针对不同E2泛素偶联酶的特异性。其它RING 锌指蛋白可结合核酸或与其它蛋白质靶标相互作用。除了泛素介导的降解途径外，RING锌指蛋白还在细胞器运输和转录/翻译调节中起着重要作用。在水稻中，鉴定了超过30种针对水稻黄单孢菌水稻致病变种 (Za"Aomo"w o^za pv. or;;za) (Xoo)的抗性基因座(7a基因座)，主要通过绘图 克隆方法(map-based cloning approache)克隆了 6种^Ta基因。据报道，几种发 病机理-相关(尸/ )基因对抗性机制直接起作用。然而，从R蛋白-Avr蛋白开始 相互作用到实际抵抗力产生的信号转导途径中只有少数关键组分得到研究。为 获得水稻的新的Xoo抗性相关信号转导组分，研究了在水稻品系中差别表达的 具有^a基因座的cDNA克隆。本专利技术人克隆并表征了水稻的新型RING锌指蛋白基因(6W Z/C7)。在创伤情况下，o^z/cv在含7 ^或耐受性基因座的近等同基因品系中差别表达，但在相应的易感回归亲本中不是。cw /zc/在转基因拟南芥中的异位表达增强其对细菌病原体的抵抗力，这种保护功能取决于26S蛋白酶体的作用。
技术实现思路
已知植物中有各种基因编码感染抗性蛋白质，己经利用了经修饰产生这些蛋白质的各种转基因植物以图赋予针对感染的抵抗力。然而，就成功识别的病原体类型而言，这些抗性蛋白质看来活性谱有限。许多还导致不利副作用(例如，程序性细胞死亡)。本专利技术提供可用于赋予各种植物针对感染的抵抗力，而没有明显不利副作用的材料。本专利技术提供产生称为OsRHCI的蛋白质的重组材料，该蛋白质是赋予针对广谱病原体感染的抵抗力的RING锌指蛋白。由于源自单子叶植物(水稻)的本专利技术蛋白质在双子叶植物(拟南芥)中也有效，其也适用于各种植物。一方面，本专利技术涉及产生OsRHCl蛋白及其密切相关蛋白的表达系统，所述蛋白是RING锌指蛋白并能增强植物对感染的抵抗力。用本专利技术表达系统修饰的转基因植物抵抗病原生物或创伤所致感染的能力增强。因此，在另一方面，本专利技术涉及经修饰而含有产生该RING锌指蛋白的表达系统的植物细胞或植物。这些植物可以是OsRHCl来源的异源植物，或者可以是经修饰而过表达该蛋白质的水稻植物。在还有另一方面，该表达系统产生的蛋白质可以用于实施筛选试验以鉴定能调节植物对感染的抵抗力的化合物或化合物组合。本专利技术还涉及OsRHCl蛋白的免疫特异性抗体。这些抗体可用于检测和纯化该蛋白质。附图简述附图说明图1显示0^//C7基因编码区的核苷酸序列和OsRHCl蛋白的氨基酸序列(SEQIDNO:42-43)。图2A显示与表现出高度相似性的7种注释蛋白质(SEQ ID NO:44-50)比对的OsRHCl的全长氨基酸序列(SEQIDNO:43)。图2B显示利用抗-OsRHCl抗体作蛋白质印迹分析的从CBB23和JG30提取的膜结合和可溶性蛋白质组分。图3A和3B显示CW /ZC7在细菌枯萎病抗性品系CBB14和CBB23(分另'J携带基因座和基因座)和它们的易感回归亲本(分别是SN1033和JG30)中的表达情况。图4A通过实时PCR显示CW /ZC7的创伤诱导表达。图4B显示相应蛋白质的蛋白质印迹。图5A-C显示表达CW i/C/的转基因拟南芥的病原体接种测试。在图5A中，通过Northern印迹分析证实转基因O^Z/C7在转基因拟南芥中的表达。疾病症状可见，如图5B所示；收集莲座丛(rosette)叶片(不是感染的部位)估计病原体滴度，如图5C所示。图6A和6B显示防御标记基因在未接种(A)和接种(B)丁香假单胞菌番茄致病变种(尸"wc/omo"w ^W"gae pv. "wWo) DC3000 (尸w DC3000)的转基因拟南芥中的表达。图7A-D显示用MG132 (26S蛋白酶体抑制剂)处理时防御标记基因(尸/^(A)、尸/ 2(B)、尸DFA2(C)和7Tn'2./(D))的表达。图8A和8B显示在"/ W-3背景中Osi i/C/转基因拟南芥的病原体接种测试的结果。图8A显示0^7/C/基因的表达，图8B显示4种防御标记基因的表达。图9显示在转基因水稻品系中PCR筛选CW /ZC/转基因的结果。图10A通过实时PCR显示Os/ //C7的表达，图10B显示转基因水稻品系中相应蛋白质的产生。图11A-C显示as/ //C7转基因水稻品系中防御标记基因尸A/ (A)、尸5Z/ (B)和G7 C『尸(C)的表达。图12显示对OsRHCl的RING-HC-C-末端部分进行自泛素化试验(autoubiquitin本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种重组表达系统，其包含编码蛋白质或其变体的核苷酸序列，所述蛋白质具有图１所示氨基酸序列，而所述变体与所述氨基酸序列具有至少９５％相同性，并且所述蛋白质或其变体赋予植物对外伤的抵抗力，其中所述核苷酸序列与在植物细胞实现表达的调控体系操作性相连。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：SSM孙，林汉明，
申请(专利权)人：香港中文大学，
类型：发明
国别省市：HK[中国|香港]