用于体外受精的组合物制造技术

一种含有一种减数分裂激活物质的固体组合物可以通过添加一种蛋白质或一种磷酸甘油酯来制备。（*该技术在2020年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种可被用于体外受精的固体产物。当MAS被保持在含有卵母细胞的培养基中时，卵母细胞变得更加容易受精。然而，使用MAS的主要问题在于它们通常具有非常低的溶解度。本专利技术的另一个目的是研制一种含有MAS或其一种不需要任何物理干预如加热、搅拌或超声波处理就能溶于水介质中的衍生物的组合物。本专利技术的详述优选的MAS，即FF-MAS，在水中的溶解度很小，即大约为20皮克/ml(相当于2×10-5μg/ml)，而在乙醇中的溶解度相当大，即大约为4mg/ml。根据我们的初步研究，FF-MAS在乙醇和水(1∶2.5)中的最大溶解度大约为0.4mg/ml。几种其它的MAS在水中也具有类似低的溶解度。令人惊奇地是，目前已经发现含有MAS和一种添加剂的固体组合物在水中具有良好的溶解性。所述添加剂是这样一种组分，当添加到MAS中时，可以提供一种能被用来制备一种含有MAS的水溶液的组合物。所述添加剂的实例是水溶性蛋白质如血清白蛋白，例如人血清白蛋白(本文被称作HSA)，选择性地以重组的形式存在，酶和磷酸甘油酯如磷脂酰乙醇胺、磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇。优选地，本专利技术的组合物的含量低于10％，优选地低于5％，更优选地低于1％(重量/重量)。优选地，本专利技术的组合物中的有机溶剂含量低于10％，优选地低于5％，更优选地低于1％(重量/重量)。优选地，本专利技术的组合物的MAS含量低于1％，优选地低于0.1％，更优选地低于0.05％(重量/重量)。优选地，本专利技术的组合物的添加剂含量高于99％，更优选地高于99.9％。本专利技术的优选组合物是这样一种组合物，其可以用不含有或只含有低浓度有机溶剂的水介质进行处理产生一种含有MAS的溶液。优选地，这些水介质含有少于1％，优选地少于0.5％，更优选地少于0.1％的有机溶剂(重量/重量)。早期，为了满足这一要求所进行的数次尝试都失败了。本文中，术语MAS是指介导卵母细胞进行减数分裂的化合物。更具体地，MAS是在下述实施例1中的试验中具有明显高于对照的生发泡裂解(下文被称作GVB)百分率的化合物。优选的MAS具有至少50％的GVB百分率，优选地至少80％。优选的MAS的实例是4，4-二甲基-5α-胆甾-8，14，24-三烯-3β-醇(下文称作FF-MAS)；4，4-二甲基-5α-胆甾-8，14，24-三烯-3β-醇半琥珀酸酯；5α-胆甾-8，14-二烯-3β-醇；5α-胆甾-8，14-二烯-3β-醇半琥珀酸酯；(20S)-胆甾-5-烯-3β，20-二醇；3β-羟基-4，4-二甲基-5α-胆甾-8，14-二烯-24-酸-N-(甲硫氨酸)酰胺；和胆甾-5-烯-16β-醇。其它的MAS实例是在WO 96/00235，96/27658，97/00884，98/28323，98/54965和98/55498中提到的MAS，更具体地是在其权利要求1中提到的MAS。制备本专利技术的组合物的一种方法是将MAS在有机溶剂如乙醇中的溶液与添加剂的水溶液混合，然后直到所述溶剂蒸发尽。通过利用该产物上方持续流动的空气、真空或任何其它用于除去溶剂的可行方法来加快蒸发进程。被销售的该产物可以是一种具有一个或多个凹或穴的递送系统。下文中，这些凹和穴被相互称作穴。这些穴中的至少一个含有一种本专利技术的组合物。放置该固体MAS的合理可行的方法是首先将含有MAS和所述添加剂的溶液放置在穴中，然后使该溶液进行蒸发。以这种方式获得的蒸发残留物，即本专利技术的组合物被直接置于所述装置(递送系统)的穴中。由于本专利技术的组合物被用于卵母细胞的处理，所以对于本专利技术的组合物来说，不含对卵母细胞产生负面影响的组分是相当重要的。使用本专利技术组合物的一种方法是在水介质如水中溶解该组合物，然后，如果需要，添加其它的对卵母细胞的成熟可能具有有益影响的组分。使用本专利技术组合物的另一种方法是在一种通常用于体外成熟的介质中溶解该组合物。本专利技术通过下列实施例得到进一步说明，然而，这些实施例并不能被解释为对本专利技术保护范围的限制。以上说明书和以下实施例中记载的特征可以以任何结合的方式成为以不同形式实现本专利技术的物质。实施例1 用于测定一种化合物是否为MAS的方法从体重为13-16克的未成熟雌性小鼠(C57BL/6J x DBA/2J F1，Bomholtgaard，丹麦)中获得卵母细胞，然后将该卵母细胞保存在控制温度(20-22℃)，光线(以6.00-18.00照射)和相对湿度(50-70％)下。给所述小鼠腹膜内注射0.2ml含20 IU FSH的促性腺激素(Gonal-F，Serono)，并且48小时后采用颈转位处死所述小鼠。剥离出小鼠的卵巢并且通过在立体显微镜下和Hx-介质(如下所示)中使用一对27号的针手工刺破卵泡来分离卵母细胞。显示完整生发泡(下文称作GV)的球形卵母细胞被分成丘封闭卵母细胞(下文称作CEO)和裸露卵母细胞(下文称作NO)并被放置在添加了3mg/ml牛血清白蛋白(BSA，Sigma Cat.No.A-7030)，5mg/ml人血清白蛋白(HSA，国家血清研究所(State SerumInstitute)，丹麦)，0.23mM丙酮酸酯(Sigma，Cat.No S-8636)，2mM谷氨酰胺(Flow Cat.No.16-801)，100 IU/ml青霉素和100μg/ml链霉素(Flow，Cat No.16-700)的α-极限必需培养基(不含核糖核苷的α-MEM，Gibco BRL，Cat.No.22561)中。该培养基添加了3mM次黄嘌呤(Sigma Cat.No.H-9377)并被命名为Hx-培养基。所述卵母细胞用Hx-培养基冲洗三次并且将大小一致的卵母细胞分成CEO和NO两组。将CEO和NO培养在4-孔多孔平皿(multidishes)(Nunclon，丹麦)中，每孔中含有0.4ml Hx-培养基和浓度为10μM的待检测化合物。1个对照孔(即，在不加待检测化合物的相同培养基中培养的35-45个卵母细胞)总是与3个测试孔(每个添加了待检测化合物的孔中35-45个卵母细胞)同时进行培养。所述卵母细胞在含5％CO2的潮湿环境中于37℃下培养24小时。培养结束时，采用立体显微镜(Wildt，Leica MZ 12)分别对具有GV，GVB和极性体(下文称作PB)的卵母细胞数目进行计数。GVB的百分率，被定义为该孔中经历GVB的卵母细胞相对卵母细胞总数的百分率，如下进行计算％GVB＝((GVB的数目+PB的数目)/卵母细胞的总数)×100。实施例2 用于测定一种化合物是否能被用作本专利技术组合物中的添加剂的方法用于FF-MAS组合物的添加剂的特征在于改善FF-MAS在乙醇/水(1∶2.5v/v)中的溶解度；在MEMα培养基中重新配制组合物后确保得到FF-MAS的清澄溶液；当对从未成熟雌性小鼠中获得的卵母细胞进行测试时，确保GVB百分率至少为50％。制备饱和的FF-MAS乙醇溶液。以1∶2.5的比例与添加剂的水溶液混合。通过目测控制过剩的FF-MAS可以在所述溶液中获得。在室温下使所述溶液旋转24小时。通过0.22μm的过滤器过滤所述溶液，通过HPLC测定FF-MAS的含量并且计算溶解度。将350μl转移到4-孔平皿中并在室温下蒸发至干。加入500μ本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种含有ＭＡＳ和一种添加剂的固体产物。

【技术特征摘要】
DK 1999-9-16 PA1999013081.一种含有MAS和一种添加剂的固体产物。2.一种如权利要求1所述的组合物，其特征在于其中水的含量低于10％，优选地低于5％，更优选地低于1％(重量/重量)。3.一种如权利要求1或2所述的组合物，其特征在于其中有机溶剂的含量低于10％，优选地低于5％，更优选地低于1％(重量/重量)。4.一种如上述权利要求中的任一项权利要求所述的组合物，其特征在于其中MAS的含量低于50％，优选地低于20％，更优选地低于10％，最优选地低于5％(重量/重量)。5.一种如上述权利要求中的任一项权利要求所述的组合物，其特征在于MAS是4，4-二甲基-5α-胆甾-8，14，24-三烯-3β-醇；4，4-二甲基-5α-胆甾-8，14，24-三烯-3β-醇半琥珀酸酯；5α-胆甾-8，14-二烯-3β-醇；5α-胆甾-8，14-二烯-3β-醇半琥珀酸酯；(20S)-胆甾-5-烯-3β，20-二醇；3β-羟基-4，4-二甲基-5α-胆甾-8，14-二烯-24-酸-N-(甲硫氨酸)酰胺；和胆甾-5-烯-16β-醇。6.一种如上述权利要...

【专利技术属性】
技术研发人员：TM安德尔森，
申请(专利权)人：诺沃挪第克公司，
类型：发明
国别省市：DK[丹麦]