用于生产琥珀酸的微生物制造技术

本发明专利技术涉及分离的遗传修饰的微生物，其中基因ＳＤＨ２和ＤＩＣ１的至少一种以及基因ＩＤＨ１在第一启动子的控制下，其中所述第一启动子通过培养添加剂被阻遏于生长培养基，在缺乏所述培养添加剂时所述启动子是有活性的。作为包含“ＰＹＣ１、ＡＣＳ１、ＣＩＴ１、ＡＣＯ１、ＩＣＬ１、ＭＬＳ１和ＣＩＴ２，以及任选地还有ＭＤＨ３”的组的一部分的基因是组成性活性的。本发明专利技术还涉及这类微生物的应用，尤其是用于生产琥珀酸。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于生产琥珀酸的微生物
本专利技术涉及包含基因SDH2和/或DIC1的至少一种以及基因IDH1的微生物，涉及这样的微生物的应用以及涉及用于其生产的方法。
技术介绍
二羧酸具有高度的经济潜力，因为它们可以被用作许多化学制品的前体物质。例如，琥珀酸用作用于基于1，4-丁二醇、四氢呋喃和γ-丁内酯的塑料生产的初始阶段。今天，琥珀酸通过马来酸酐催化水合为琥珀酸酐并随后水加成或通过马来酸的直接催化水合而化学生产。琥珀酸也通过许多微生物在生理环境条件下从糖或氨基酸形成。在厌氧条件下，除了琥珀酸外，通常形成进一步发酵终产物如乙醇、乳酸、乙酸和蚁酸，。具有其高氧含量的琥珀酸的生物合成需要CO2的还原固定(reduktiveCO2-Fixierung)。琥珀酸是代谢物，其通常通过厌氧发酵过程富集。而厌氧条件下所述产物的产率和富集是需氧条件下的几倍，完全厌氧过程的缺点是生物量(biomassen)生产的技术限制和微生物生产者的低生产力。因此，结果是较低的生物量/产物效率。此外，难以严格地技术处理厌氧微生物。能够在厌氧条件下合成琥珀酸的多种微生物在本领域是已知的。文件US5,143,834描述了产琥珀酸厌氧螺菌(A.succiniciproducens)的变异体。这是专性的厌氧微生物，其仅可以产生中等量的琥珀酸，此外不能耐受高渗透压和盐浓度。文件US7,063,968描述了微生物瘤胃分离物，曼海姆菌(Mannheimiasp.)55E，其能够在需氧和厌氧条件下合成有机酸。然而，这不是琥珀酸的特异性富集，而是不同有机酸的混合物，如蚁酸、乙酸、乳酸、和琥珀酸。这种生产者的缺点是所述菌株的经济应用即使不是不可能，也仅仅是很难实现的，因为为了获得琥珀酸，不得不采用昂贵的富集和纯化方法。文件US5,869,301描述了用于在两步发酵过程中利用大肠杆菌(E.coli)AFP-111生产二羧酸的方法，其中在第一阶段微生物的生物量在需氧条件下产生，在第二阶段，琥珀酸的生产以厌氧方式进行。生物量产生的第一阶段被限制在这个过程中，因为，在分批供料过程中葡萄糖浓度必须被限制为1g/L，以便避免扰乱生物量生产过程和琥珀酸生产的乙酸盐的富集。因此，通过这个过程的产生生物量的可能性非常小。此外，在这个过程中琥珀酸的生物合成途径受到强烈的代谢物阻遏，因为糖酵解、柠檬酸循环和乙醛酸途径的基因被葡萄糖强烈地阻遏，这可以从文件DeRisiJ.L.，IyerV.R.，BrownP.O.，Science278(5338)：680-686(1997)获知。结果是在存在葡萄糖时琥珀酸的合成被很大程度地阻遏并由此受到强烈受限。根据文件US6,190,914的微生物是本领域已知的，其中通过合适的转录因子和激酶的调变(modulation)，多种基因的葡萄糖阻遏被减少。但在其中无法获取通过这样的微生物生产有机酸，特别是以及进一步获取用于生产针对有机酸而被优化的微生物。专利技术目的因此本专利技术的技术目的是详细说明一种方法和用于实施后者的微生物，其允许在发酵过程中没有限制地生产生物量，产生乙醛酸循环的羧酸，尤其是琥珀酸，而在生产过程中没有生物合成途径中的代谢物阻遏，以及确保在所述生产阶段期间尽可能低的副产品富集。专利技术基础和优选的实施方式为了实现这个技术目的，本专利技术教导了分离的遗传修饰的微生物，其中基因DIC1和SDH2的至少一种或二者以及基因IDH1在第一外源启动子的控制下，所述第一外源启动子通过培养添加剂被阻遏于生长培养基，在缺乏所述培养添加剂时所述启动子是有活性的，以及这样的微生物在用于产生乙醛酸循环的羧酸(尤其是二羧酸，例如琥珀酸)的方法中的应用，所述方法包括下面的步骤：a)所述微生物在生长培养基中被培养并繁殖；b)随后所述微生物被转移入生产培养基，所述生产培养基包含阻遏所述第一启动子的培养添加剂，或者阻遏所述第一启动子的培养添加剂被加入到所述生长培养基并被培养(如果在需氧或厌氧条件下适用)；以及c)在步骤b)后或步骤b)期间，从培养物上清液分离羧酸并任选地被纯化。此外，通过根据本专利技术的微生物或方法，通过合适的基因阻遏，乙醛酸或柠檬酸循环的多种中间产物可以作为所述生产方法的终产物被特异性产生。当基因IDH1、SDH2和DIC1在第一外源启动子的控制下时，产生的羧酸为琥珀酸(琥珀酸盐)。当基因SDH2和DIC1不在第一外源启动子的控制下，并且基因IDH1、FUM1和OSM1在第一外源启动子的控制下时，产生的羧酸为延胡索酸(延胡索酸盐)。当基因FUM1和OSM1不在第一外源启动子的控制下，并且基因IDH1和MDH3在第一外源启动子的控制下时，产生的羧酸为马来酸(苹果酸盐)。当基因MDH3不在第一外源启动子的控制下，并且基因IDH1和CIT2在第一外源启动子的控制下时，产生的羧酸为草酰乙酸(草酰乙酸盐)。本专利技术利用下面的发现并实现下面的优点。在细胞呼吸期间，还原当量()从柠檬酸循环获得，其中琥珀酸是中间产物，所述还原当量导致线粒体膜系统内电位的产生。这种膜电位随后在呼吸链的过程中用于产生ATP形式的能量。此外，碳在合成代谢过程中通过柠檬酸循环被有效地转化为生物量。这种形式的增能(Energetisierung)非常有效并且导致细胞的最佳生长。然而只要柠檬酸循环和呼吸链存在于线粒体膜中，它就仅是可能的。除了柠檬酸循环，乙醛酸代谢途径在酵母酿酒酵母(Saccharomvcescerevisiae)中存在(还参见图1)。它是一类“简化的”(″Kurzschluss″)柠檬酸循环，因为异柠檬酸作为代谢物从所述代谢途径去除，一分子的琥珀酸和乙醛酸各自被形成。只要柠檬酸循环是活化的，那么琥珀酸和乙醛酸将通过分子乙酰辅酶A(乙醇或乙酸的)被结合到乙醛酸而流回到柠檬酸循环，并从其中产生苹果酸。乙醛酸循环允许细胞通过乙酰辅酶A进入柠檬酸循环而无碳损失地供应C2碳源，因为从异柠檬酸到琥珀酰辅酶A的两个氧化脱羧步骤被旁路化。天然地，乙醛酸循环，例如在酵母细胞中，在存在葡萄糖时，在转录上被强烈地阻遏，结果是这个代谢途径不是活化的。仅在葡萄糖完全耗尽时，并且乙醇在培养基中富集时，涉及的基因在转录上被去阻遏。这个形式的调节通过乙醛酸代谢途径的生物学含义被解释，即，C2碳化合物如乙醇或乙酸的再补充或代谢，以便在糖降解分解期间通过这些C2碳化合物的产生来补充碳损失。所述生物合成途径尤其在植物、真菌和酵母中被发现。琥珀酸在呼吸阶段(需氧阶段)期间的富集以及由此所述阶段(其中微生物获得生物量)没有意义，因为碳被充分需要用于合成代谢过程。然而如果通过限制培养基成分终止稳定期中生物量的增加，那么柠檬酸循环不再被细胞所需。这个时间可以用于通过培养通过碳通量偏移入乙醛酸循环并由此有效进入琥珀酸合成来实现琥珀酸的特异性富集。为了实现碳通量的这种代谢偏移，在中间产物异柠檬酸和琥珀酸后柠檬酸循环被中断，以便碳通量偏移进入乙醛酸循环，琥珀酸的进一步代谢被防止或改道为乙醛酸循环的进一步的中间产物。此外，琥珀酸从乙醛酸循环进入线粒体的转运被中断，以便它不再可用于位于线粒体内的柠檬酸循环。此外，细胞的天然调节机制必须被克服，因为为了琥珀酸中通过乙醛酸途径的有效碳开发，葡萄糖(其天然阻遏所述代谢途径)被用作碳源。对于其中最初在本文档来自技高网...

【技术保护点】
分离的遗传修饰的微生物，其中天然基因ＭＤＨ２被基因ＭＤＨ２的截短的变体置换或补充，和／或天然基因ＦＵＭ１被来自不同于所述微生物的生物体的基因ＦＵＭ１置换或补充，和／或其中基因ＦＲＤＳ１被过度表达，和／或基因ＰＹＣ１和／或ＰＹＣ２之一或二者被过度表达。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】DE 2007-4-20 102007019184.91.分离的遗传修饰的微生物，其中天然基因MDH2被基因MDH2的截短的变体置换，和天然基因FUM1被来自不同于所述微生物的生物体的基因FUM1置换，和其中基因FRDS1被过度表达，和基因PYC1和/或PYC2之一或二者被过度表达。2.根据权利要求1所述的微生物，其中基因MDH2的截短的变体编码MDH2蛋白，其最初的12个N－末端氨基酸，以及，任选地，C－末端脯氨酸被缩短。3.根据权利要求1或2所述的微生物，其中所述微生物为酵母，并且其中基因FUM1选自包括“大肠杆菌、产琥珀酸厌氧螺菌、琥珀酸放线杆菌、Mannheimiasucciniciproducens、谷氨酸棒杆菌”的组的生物体。4.根据权利要求3所述的微生物，其中所述酵母选自包括“酵母菌属、复膜孢子酵母属、类酵母属、裂殖酵母属、威克酵母属、德巴利氏酵母属、汉逊酵母属、有孢汉逊酵母属、毕赤氏酵母属、克勒克酵母属、假丝酵母属、接合酵母属、Ogataea、Kuraishia、Komagataella、Yarrowia、梅奇氏酵母属、拟威尔酵母属、Nakazawaea、克鲁维酵母属、隐球酵母属、孢圆酵母属、布勒掷孢酵母属、红酵母、Willopsis和掷孢酵母属”的组。5.根据权利要求3所述的微生物，其中所述酵母是酿酒酵母。6.根据权利要求1或2所述的微生物，其中来自包括“FRDS1、PYC1和PYC2”的组的基因的至少一种在第二外源、组成性活性启动子的控制下。7.根据权利要求6所述的微生物，其中所述第二外源、组成性活性启动子是ADH1启动子。8.根据权利要求1~7任一项所述的微生物在琥珀酸生产中的应用。9.根据权利要求1~7任一项所述的微生物在用于琥珀酸生产的方法中的应用，其中所述方法包括下面的步骤：a）任选地，在需氧条件下在生长培养基中培养并繁殖所述微生物，b）随后，任选地在厌氧条件下培养所述微生物，以及c)在步骤b)之后或步骤b)期间，从培养物上清液分离琥珀酸，并任选地进行纯化。10.根据权利要求9所述的应用，其中步骤a）被实施直到至少100g干生物量/l的细胞密度。11.根据权利要求9所述的应用，其中步骤a）被实施直到至少120g干生物量/l的细胞密度。12.根据权利要求9所述的应用，其中步骤a）被实施...

【专利技术属性】
技术研发人员：C兰，M维恩，M博特纳，A拉布，
申请(专利权)人：器官平衡有限责任公司，
类型：发明
国别省市：DE[德国]