抗幽门螺旋杆菌的新免疫球蛋白制造技术

本发明专利技术涉及用于预防、治疗和诊断幽门螺旋杆菌引起的感染的材料和方法。更具体地说，本发明专利技术涉及新的特异性抗体可变区，其衍生物和完全人免疫球蛋白Ａｂｂａ３，其显示对幽门螺旋杆菌表达的ＢａｂＡ抗原具有特异性活性，且与岩藻糖基化ＡＢＯ／Ｌｅｗｉｓ？ｂ血型抗原（Ｌｅｂ）竞争结合ＢａｂＡ。本发明专利技术还涉及生产所述免疫球蛋白的方法，它们的分离和用途，例如检测由幽门螺旋杆菌引起的疾病。本发明专利技术还涉及治疗和预防幽门螺旋杆菌菌株引起的病理性感染的免疫疗法，即被动疫苗接种。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及用于预防、治疗和诊断由幽门螺旋杆菌(Hel icobacterpylori ， H. pylori)引起的感染的材料和方法。更具体地说，本专利技术涉及新的特异性抗体可变区，其 衍生物和完全人免疫球蛋白Abba3，其显示对幽门螺旋杆菌表达的BabA抗原具有特异性 活性，生产所述免疫球蛋白的方法，它们的分离和用途，例如检测由幽门螺旋杆菌引起的疾 病。本专利技术还涉及治疗和预防幽门螺旋杆菌菌株引起的病理性感染的免疫疗法，即被动疫 苗接种。
技术介绍
幽门螺旋杆菌是革兰氏阴性细菌，定居在人胃粘膜，引起慢性胃炎，慢性胃炎可以 发展为消化性溃疡和胃癌(6)。幽门螺旋杆菌在其表面表达粘附素，粘附素使得其与胃粘膜 紧密粘附，以容许这些营养缺陷型生物从宿主组织获得营养。BabA粘附素是外膜蛋白平行 同源家族的成员(2)，其与在上皮细胞上表达的岩藻糖基化AB0/Lewis b血型抗原结合(7， 22)。 BabA是一种可能的疫苗候选物，因为临床分离物中高比例显示出表达BabA(22， 26,33)。由于胃肠道中免疫活性低，抗幽门螺旋杆菌的主动疫苗接种很困难。 一个其他问 题是幽门螺旋杆菌的高重组率。被动免疫反而更有利，因为Abba3抗体与抗原结合，使得幽 门螺旋杆菌难于附着于粘膜。 最近的研究也已经证明BabA表达与消化性溃疡和胃癌的发展之间有显著的 关联(16,36)。现在，正在研究递送高度ABO/Lewis b岩藻糖基化糖缀合物进行被动免 疫疗法的可能性(18，43)。做为选择，干扰粘膜粘附的抗体衍生物可以口服给予或由 GRAS (GenerallyRecognised As Safe,公认安全的)微生物在原位产生，正如口服给予抗幽 门螺旋杆菌的IgG(ll，25)，或给予表达抗链球菌突变株的单链可变片段(scFv)的乳酸杆 菌(30)所显示。scFv是一种由免疫球蛋白的可变重链(VH)和轻链(VL)通过灵活的肽接 头连接组成的基因工程抗体。 胃中细菌不仅仅面临着宿主特定环境条件，而且要面对病变进展过程中粘膜糖基 化模式的改变。尽管如此，幽门螺旋杆菌仍具有产生慢性和持续感染的卓越能力，这可能是 由于它出奇高的重组率(15)。 幽门螺旋杆菌紧密粘附和不粘附之间转换的能力使得该细菌得到从炎症组织渗 漏的营养物，但同时也使细菌暴露于宿主炎症反应(37)。 BabA通过以下方法有助于结合灵活性富含CT的引导序列中基于移码的变异， 与BabA密切相关的外膜蛋白(OMPs)在它的N-和C_末端区域但位于不同位点的babB和 babC (4， 5， 40)的水平基因转移和基因转换。尽管BabA主要发现在babA位点中，但是与位于 babB位点中的BabB的基因转换导致较弱BabB启动子控制下的全长BabA形成或产生BabA 区别于BabB的独特区域上游重组位点的嵌合BabA/BabB基因(12)。在受感染猕猴和患者 中，重组还可以引起babA位点内BabB的存在，及随后Lewis b结合的丧失(12，20，40)。第 三个位点BabC，以前仅在26695菌株中描述过，最近在另外的菌株中也表明其涉及与BabA的重组交换。 Backstr6m等(5)已经表明已失去结合Lewis b能力的临床幽门螺旋杆菌分离株 当中， 一小部分细菌群隐匿BabB/BabA嵌合体，并且体外通过与磁珠包被的Lewis b淘选可 以重建Lewis b结合。这将使细菌对宿主炎症反应时糖基化模式的改变产生应答。基因转 换引起嵌合型BabA形成，但是CBD(碳水化合物结合结构域)突变将引起功能丧失并由此 引起幽门螺旋杆菌急性传染期的存活率降低，其中血型抗原仍然在上皮细胞上高度表达。 恒河猴试验性感染末期，所分析菌株中babA位点中唯独babB的存在产生了抗原 变异用来避免宿主免疫应答的假说(40)。在两份报道中测试了患者血清中幽门螺旋杆菌抗 原的抗原性，但是因为在二维分离前，蛋白被尿素变性，检测构象依赖性膜蛋白的可能性颇 受限制(19， 27)。 用分离自包涵体的重组BabA(44)免疫兔子已经产生了多克隆抗BabA血清，并且 在大多数菌株中显示出识别BabA。迄今为止，已经描述了两个单克隆BabA特异性scFv， 其用BabA-GST融合蛋白免疫啮齿动物而产生，范围覆盖BabA-J99结构域的氨基酸128至 310(21)。 Western印迹分析所分析的菌株仅仅大约一半是阳性的，可能由于与多克隆血清 相比单克隆抗体有更多限制表位。此外，对仅含一部分BabA，没有明确功能性构象的蛋白进 行所描述scFv的噬菌体选择。 预防通过粘膜部位传播传染性疾病的新方法包括通过乳酸杆菌或其他GRAS微生 物原位递送抗体片段(30)。 以前已经鉴定了 BabA粘附素并表明位于幽门螺旋杆菌细菌的表面(SE 9602287-6)。血型结合活性显示pH依赖性，本专利技术人现在证明了与Lewis-b受体结合的亲 和力揭示高平衡常数。 深入研究涉及由幽门螺旋杆菌引起的感染的免疫治疗和预防。EP0484148(Ando & Nakamura)描述了治疗和/或预防哺乳动物中上胃肠道疾病的方法，所述方法包括将含抗 幽门螺旋杆菌多克隆免疫球蛋白和药物可接受载体的有效量的药物组合物口服给予需要 其的患者。该说明书进一步详述了所述疗法与给予抗生素结合的联合方法。作为生产所述 多克隆抗体的方法，EP 0484148描述了从哺乳动物血清和乳汁中分离和纯化抗幽门螺旋杆 菌免疫球蛋白。根据EP 0484148，在牛、山羊、绵羊、猪或马的胃中没有发现幽门螺旋杆菌 本身，但是人们认为这些动物物种中已经定居了具有与幽门螺旋杆菌抗原决定簇类似的决 定簇的微生物，因为它们具有与在人类中发现的幽门螺旋杆菌菌株有交叉反应的免疫球蛋 白。根据EP 0484148，优选大型哺乳动物例如妊娠牛，用幽门螺旋杆菌全细胞免疫，和随后 从乳汁或初乳中提取免疫球蛋白。在免疫实验中，使用NCTC菌株11362和临床分离株幽 门螺旋杆菌No. 153触发免疫球蛋白的产生。另一方面，使用NCTC菌株11637进行分析目 的。声称免疫在乳汁中产生了如此幅度的抗幽门螺旋杆菌滴度，日剂量O.Ol-O. lg/天免疫 球蛋白成分，足以进行成功的治疗。然而Ando & Nakamura提供的实验不支持O.Ol-O. lg/ 天的声称区间，因此至今在临床试验中未能证明如此低的剂量有效。实施例5和7中实际 使用的剂量是lg/天的数量级，即已给出的区间上限的10倍。此外，Ando & Nakamura制 备的非特异性免疫球蛋白混合物在所声称剂量下是有效的几乎不大可能，因为类似的剂量 抗其他胃肠病原体无效。在该说明书中广泛论述的同时给予抗生素，强调了所公开免疫球 蛋白的不足。 EP 0469359 (Cordle & Schaller)同样描述了用福尔马林杀死的幽门螺旋杆菌细 菌(ATCC菌株26695)免疫哺乳动物，优选妊娠牛。从乳汁中分离和纯化抗幽门螺旋杆菌多 克隆抗体，并最后饲喂给小猪，总量大约O. 5g免疫球蛋白，每天三次。通过测定活检标本中 试验后革兰氏阴性细菌呈阳性的数量来评价结果。在饲喂非免疫本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种鉴定和选择对ＢａｂＡ蛋白具有特异性的人ｓｃＦｖ抗体片段，尤其是竞争结合Ｌｅｗｉｓｂ抗原（Ｌｅｂ）的ｓｃＦｖ克隆的方法，所述方法包括：ａ）选择感染幽门螺旋杆菌的患者，其血清证明对ＢａｂＡ介导的细菌结合Ｌｅｗｉｓｂ抗原具有竞争性结合活性；ｂ）从抑制阳性血清的患者外周血单核细胞中分离ＲＮＡ，通过产生用于扩增编码抗体Ｖ区的基因的相应ｃＤＮＡ，构建噬菌体展示ｓｃＦｖ文库；ｃ）用来自幽门螺旋杆菌的纯化的天然ＢａｂＡ粘附素探测该文库；ｄ）鉴定特异性结合幽门螺旋杆菌ＢａｂＡ的克隆；和ｅ）完成克隆以形成通过与ＢａｂＡ结合而中和幽门螺旋杆菌的完全人ＩｇＧ１抗体。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：托马斯博伦，伦纳特哈马斯特伦，
申请(专利权)人：海利库有限公司，
类型：发明
国别省市：SE[瑞典]