【技术实现步骤摘要】
本申请涉及微流控，特别是涉及一种基于多重标记构建肿瘤微环境的微流控芯片及其应用。
技术介绍
1、恶性肿瘤是全球范围内最主要的健康问题之一，严重影响了人们的生活质量。而肿瘤的发生发展是一个进化的生态过程，肿瘤微环境(tme)之间不断的相互作用在肿瘤的进展、转移和对治疗的反应中起着决定性作用，因此，为了深入了解肿瘤疾病的机制，发展相应的治疗方案，系统性地解析肿瘤微环境中不同细胞的表型是认识肿瘤发生发展、提高免疫疗效的关键。常规的研究手段如流式细胞术、基因检测等技术可以对肿瘤区域内的目标细胞群进行定性、定量，但无法获取肿瘤区域形态学上的信息以及不同标志物之间的相对空间分布特征。常规的组织切片化学染色技术和免疫组织化学技术目前已经发展到可以进行量化分析，这些研究大多可用于估计肿瘤微环境中的免疫频率和细胞状态，但它们缺乏与实际细胞比例、细胞异质性和更深层次的空间分布相关的信息。
2、目前，多采用多重免疫荧光技术来量化肿瘤中的细胞亚群、其功能状态及其在微环境中的空间排列等，该方法能获取组织的完整形态学信息并进行原位分析，是目前检测肿瘤微环境免疫状态的核心技术。但是在常规的多重染色流程下，手工操作进行多重标记往往需要数天时间，静态溶液中的反应效率受到限制，并且较难实现实验条件的统一，存在较大的人为误差和低重现性，在单张切片上也难以呈现多种细胞群原位信息。而自动化的染色平台和设备造价昂贵，且需要大量切片和试剂、以及设备维护等人力物力资源，实验中的抗体稀释度、抗体与酪胺荧光素之间的匹配、染色顺序制定等，皆需要在反复实验后进一步地优化调
技术实现思路
1、本申请的目的是提供一种新的基于多重标记构建肿瘤微环境的微流控芯片及其应用。
2、本申请采用了以下技术方案：
3、本申请的第一方面公开了一种基于多重标记构建肿瘤微环境的微流控芯片，包括上层结构和双层芯片，使用时两者依序层叠；上层结构包括至少一个公共试剂进样口、若干个独立试剂储液池、进出气口和试剂出口；公共试剂进样口通过独立的管道与各独立试剂储液池连通；双层芯片包括依序层叠的气阀层和检测层；气阀层包括与独立试剂储液池、进出气口和试剂出口对应的通孔，以及呈气囊结构的气阀，与进出气口对应的通孔设置于气阀上，用于对气阀进行充放气；若干个独立试剂储液池对应若干个通孔，即独立试剂进样口；检测层包括与独立试剂储液池对应的若干个独立的检测微通道，检测微通道通过独立试剂进样口与其对应的独立试剂储液池连通，然后，所有检测微通道最终汇集在一起与试剂出口连通；使用时，上层结构与气阀层接触，检测层与待测切片接触，通过气阀层上的通孔，将独立试剂储液池与对应的检测微通道连通；独立检测时，通过进出气口进行充气，使气阀处于正压模式，检测层顶部为封闭的膜，气阀覆盖在检测层顶部膜的上端，向下施加压力，挤压检测层与切片紧贴，与此同时，待测切片将检测微通道的下端封闭，从而形成独立的检测通道；需要全景标记时，通过进出气口进行抽气，使气阀处于负压模式，检测层顶部膜向上鼓起，将检测层各检测微通道从下方与组织接触的面连通，在组织切片表面形成一个大腔室，从而对大腔室覆盖区域内的组织进行相同的全景标记。
4、优选地，上层结构还设置有观察窗口，气阀设置于观察窗口对应的位置。
5、优选地，气阀层和检测层分别采用聚二甲基硅氧烷制备，组装时，使检测微通道的样品入口与气阀层的独立试剂进样口对准，试剂出样口对准，气阀正对检测微通道位于其上部，即形成一个完整的双层芯片。
6、优选地，上层结构由光固化树脂材料制备。
7、本申请的另一方面公开了一种采用本申请的微流控芯片的微流控检测系统。
8、优选地，本申请的微流控检测系统包括本申请的微流控芯片，以及公共试剂模块、试剂控制模块、正压控制模块、外接气路开关、负压模块、废液收集模块；公共试剂模块包括若干个独立的公共试剂池，各公共试剂池通过独立的管道与试剂控制模块的入口端连通；试剂控制模块用于独立的控制和选择相应的公共试剂池，试剂控制模块的出口端与微流控芯片的公共试剂进样口连通；正压控制模块为外接气源，通过外接气路开关与微流控芯片的进出气口连通，用于对气阀进行充气；负压模块独立的与微流控芯片的进出气口连通，用于对气阀进行抽气；废液收集模块与微流控芯片的试剂出口连通，用于收集废液。
9、优选地，废液收集模块呈封闭状态，负压模块通过独立的管道与废液收集模块连通，用于独立的控制废液收集模块，使其保持负压状态。
10、优选地，试剂控制模块与微流控芯片的公共试剂进样口的连通管道上设置有第一流量计。
11、优选地，废液收集模块与微流控芯片的试剂出口的连通管道上设置有第二流量计。
12、优选地，微流控检测系统还包括计算机控制端，计算机控制端与试剂控制模块、正压控制模块、外接气路开关、负压模块信号连接，通过程序控制给压的具体参数、流体的切换顺序和每项进程的时间。
13、本申请的再一方面公开了本申请的微流控芯片或者本申请的微流控检测系统在多重免疫荧光检测中的应用。
14、本申请的再一方面公开了一种多重免疫荧光检测方法，包括采用本申请的微流控芯片或者本申请的微流控检测系统对同一张切片样品进行多重免疫荧光标记。
15、优选地，本申请的多重免疫荧光检测方法包括先通过进出气口进行充气，使气阀处于正压模式，在各检测微通道中分别采用不同的抗体进行标记；然后，通过进出气口进行抽气，使气阀处于负压模式，从而使检测微通道连通，在组织切片表面形成一个大腔室，对大腔室覆盖区域内的组织进行相同的全景标记。
16、优选地，本申请的多重免疫荧光检测方法还包括在全景标记后，将切片样品取出，对其进行后处理或连续染色。
17、本申请的有益效果在于：
18、本申请的微流控芯片以及基于该微流控芯片的多重免疫荧光检测，提升了染色效率，能实现流程的标准化，精准液量以及时间、流速的调整，可用于对染色结果的质量控制，有效地节省了抗体试剂和组织样本，为肿瘤微环境研究提供了一种更快速、简化、轻便的多重标记方案和途径。
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1.一种基于多重标记构建肿瘤微环境的微流控芯片，其特征在于：包括上层结构(1)和双层芯片(2)，使用时两者依序层叠；
2.根据权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于：所述上层结构(1)还设置有观察窗口(15)，所述气阀(211)设置于所述观察窗口(15)对应的位置。
3.根据权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于：所述气阀层(21)和检测层(22)分别采用聚二甲基硅氧烷制备，组装时，使检测微通道(221)的样品入口与气阀层(21)的独立试剂进样口(212)对准，试剂出样口对准，气阀(211)正对检测微通道(221)位于其上部，即形成一个完整的双层芯片(2)。
4.根据权利要求1-3任一项所述的微流控芯片，其特征在于：所述上层结构(1)由光固化树脂材料制备。
5.一种采用权利要求1-4任一项所述的微流控芯片的微流控检测系统。
6.根据权利要求5所述的微流控检测系统，其特征在于：包括权利要求1-4任一项所述的微流控芯片(01)，以及公共试剂模块(02)、试剂控制模块(03)、正压控制模块(04)、外接气路开关(05)、负压模
7.根据权利要求6所述的微流控检测系统，其特征在于：所述试剂控制模块(03)与微流控芯片(01)的公共试剂进样口(11)的连通管道上设置有第一流量计(081)；
8.权利要求1-4任一项所述的微流控芯片或者权利要求5-7任一项所述的微流控检测系统在多重免疫荧光检测中的应用。
9.一种多重免疫荧光检测方法，其特征在于：包括采用权利要求1-4任一项所述的微流控芯片或者权利要求5-7任一项所述的微流控检测系统对同一张切片样品进行多重免疫荧光标记。
10.根据权利要求9所述的多重免疫荧光检测方法，其特征在于：包括先通过进出气口(13)进行充气，使气阀(211)处于正压模式，在各检测微通道(221)中分别采用不同的抗体进行标记；然后，通过进出气口(13)进行抽气，使气阀(211)处于负压模式，使检测微通道连通，在组织切片表面形成一个大腔室，对大腔室覆盖区域内的组织进行相同的全景标记；
...【技术特征摘要】
1.一种基于多重标记构建肿瘤微环境的微流控芯片，其特征在于：包括上层结构(1)和双层芯片(2)，使用时两者依序层叠；
2.根据权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于：所述上层结构(1)还设置有观察窗口(15)，所述气阀(211)设置于所述观察窗口(15)对应的位置。
3.根据权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于：所述气阀层(21)和检测层(22)分别采用聚二甲基硅氧烷制备，组装时，使检测微通道(221)的样品入口与气阀层(21)的独立试剂进样口(212)对准，试剂出样口对准，气阀(211)正对检测微通道(221)位于其上部，即形成一个完整的双层芯片(2)。
4.根据权利要求1-3任一项所述的微流控芯片，其特征在于：所述上层结构(1)由光固化树脂材料制备。
5.一种采用权利要求1-4任一项所述的微流控芯片的微流控检测系统。
6.根据权利要求5所述的微流控检测系统，其特征在于：包括权利要求1-4任一项所述的微流控芯片(01)，以及公共试剂模块(02)、试剂控制模...
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