【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及合成生物学和生物，具体涉及一种快速组装改造的免疫球蛋白重链可变区基因座及其组装方法和应用。
技术介绍
1、抗体是由哺乳动物骨髓来源的b淋巴细胞受抗原刺激增殖和分化后的浆细胞产生，是一类可与相应抗原发生特异性结合的分泌性免疫球蛋白(immunoglobulin，ig)的总称。哺乳动物免疫球蛋白(immunoglobulin，ig)胚系基因座是由可变区(variable region,v)和恒定区(constant region,c)组成。免疫球蛋白重链基因座可变区(vh)是由可变(variable，v)、多样(diversity，d)和连接(joining，j)基因片段构成；而抗体轻链基因座可变区(vl)只有v和j基因片段。ig的胚系基因是以被分隔开的v、d、j和c基因片段存在的，只有通过基因重排形成v-d-j(lgh)或v-j(igl)连接后，再与c基因片段连接，才能编码完整且有功能的免疫球蛋白。在b细胞早期发育中，重组激活酶(recombination activatinggene,rag)识别ig胚系基因座v,d和j基因片段两端保守的重排序列(rearrangementsignal sequence,rss)后，通过dna双链断裂和修复，将ig胚系基因可变区剪接为只包含有1个v-d-j组合体(vdj重排)。重排后vdj片段与下游的c片段(ighm和ighd)共同被转录，形成多样性的抗体，因此，vdj重排是抗体多样性产生的最重要机制，是机体免疫系统针对不同抗原产生特异性抗体的基础。
2、人ig胚系重链
3、对天然的ig胚系基因座进行定向改造，使天然基因簇按后定的顺序重新排布，进一步改造基因座内特定调控元件，或增加或缺失特定基因片段等，是研究v(d)j重排机制和抗体中和活性和亲和力产生机制的重要手段。虽然从头合成双链dna技术的发展使重组dna工程更为灵活，但由于技术限制，合成片段长度通常为200-2000kb。
4、gibson组装是一种用于构建重组dna的分子生物学技术，该技术由美国加州大学爱尔兰分校的daniel g.gibson等人首次提出并发表。自那时以来，该技术经历了改进和扩展，成为合成生物学和分子生物学领域中的一种重要工具。通常，gibson组装流程首先需要在dna片段的末端加上同源片段，然后将这些dna片段和一种mix(含有三种酶)混合孵育一个小时后转化感受态细胞。这种mix含有三种不同类型的酶：1)一种外切酶，从5’端开始对dna进行消化，产生黏性末端，便于与另外的同源末端进行配对结合。2)一种聚合酶，用于修补gap。3)一种dna连接酶，实现无痕拼接，形成完整的dna分子。gibson组装技术还适用于多片段的组装，与传统一段一段构建方法相比，gibson组装技术一步即可完成多个片段的构建。
5、目前，利用常规的gibson组装技术进行长片段dna组装至少面临着以下常见的技术难点：(1)待组装的每个基因片段长度过长，且内部富含高度重复序列导致特异性引物设计困难，常规pcr难以进行；(2)需要组装的基因片段数量大，按常规流程依次组装需要耗费大量时间和精力；(3)虽然常规的gibson组装技术可以一次性连接多达6个片段，但插入片段仅为几十到数百bp，而最终组装产物仅为1-10kb级别；且当组装基因片段长和数量多时，常规的骨架载体难以承载。
技术实现思路
1、基于此，本专利技术的第一目的在于提供一种优化的基于gibson组装的人ighv区基因座组装方法，用于一步组装多个kb级别片段，可用于复杂结构基因座的高效组装。
2、本专利技术的第二目的在于提供用于改造的人ighv区基因座组装的特异性扩增用于组装的人igh功能性v基因片段的引物组合。
3、本专利技术的目的可以通过以下技术方案实现：
4、一种基于gibson组装的ighv区基因座组装方法，包括以下步骤：
5、步骤1.获取涵盖覆盖igh可变区v区基因座(ighv)的菌株或序列为pcr扩增模板；
6、步骤2.针对需要扩增的ighv目标基因片段，设计上下游特异性pcr引物，用于扩增各目标基因片段，在每对特异性引物序列的目标序列的两端引入用于gibson组装的识别序列、引入用于克隆的同源臂，所述特异性pcr引物的序列具有如下结构：
7、(1)pmigh上游gibson同源臂序列；
8、(2)限制性核酸内切酶的识别序列a；
9、(3)pcc1bac上游gibson同源臂序列和限制性核酸内切酶的识别序列b；
10、(4)能与目标基因片段的序列结合、用于特异性扩增目标基因片段的目标序列；
11、(5)需要组装的、相邻的下一个目标基因片段的gibson同源臂序列，限制性核酸内切酶的识别序列c；
12、(7)迭代gibson同源臂序列，限制性核酸内切酶的识别序列d；
13、(8)pcc1bac下游gibson同源臂序列，限制性核酸内切酶的识别序列e；
14、(9)pmigh下游gibson同源臂序列；
15、步骤3.通过步骤(2)种所述引物和pcr扩增模板进行pcr扩增，获得相应的单个目标基因片段，并改造通用载体puc19为亚克隆载，扩增获得亚克隆载体片段pmigh；每单个目标基因片段分别与亚克隆载体片段pmigh，通过gibson组装方式获得相应的pmigh-ighv质粒；
16、步骤4.从步骤3所述pmigh-ighv质粒，利用限制性内切酶对步骤3所述pmigh-ighv质粒进行消化并回收ighv目标基因片段，将按照需要组装的基因的顺序，分别将相邻的目标基因片段2-3个，分别与线性化的组装载体骨架，通过gibson组装，获得多个pcc1bac-ighv(v至v+1至v+2或v+3)的质粒，v为各目标基因片段在目标基因座上对应的顺序；
17、步骤5.再采用限制性内切酶分别线性化和双酶切，将步骤4获得的相邻的质粒依次通过gibson组装为获得组装产物。
18、在其中的一些实施例中，所述步骤4和步骤5分别如下：
19、所述步骤4和步骤5分别如下：
20、步骤4.从步骤3所述pmigh-ighv质粒，利用限制性内切酶对步骤3所述pmigh-ighv质粒进行消化并回收ighv目标本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种基于Gibson组装的IGHV区基因座组装方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的基于Gibson组装的IGHV区基因座组装方法，其特征在于，所述步骤4和步骤5分别如下：
3.根据权利要求1所述的基于Gibson组装的IGHV区基因座组装方法，其特征在于，所述限制性核酸内切酶选自XbaI、XhoI、NotI、NheI和I-CeuI中1种或2种，更优选地，所述识别序列a对应的是限制性核酸内切酶XbaI或XhoI，所述识别序列b对应的是限制性核酸内切酶NheI或SalI，所述识别序列c对应的是限制性核酸内切酶NotI，所述识别序列d对应的是限制性核酸内切酶I-CeuI，所述识别序列e对应的是限制性核酸内切酶XbaI或XhoI。
4.根据权利要求1所述的基于Gibson组装的IGHV区基因座组装方法，其特征在于，所述特异性PCR引物的序列如下所示：
5.根据权利要求1所述的基于Gibson组装的IGHV区基因座组装方法，其特征在于，用于IGHV基因片段克隆的pMIGH载体改造自pUC19克隆载体或其他商用克隆载体
6.根据权利要求1所述的基于Gibson组装的IGHV区基因座组装方法，其特征在于，步骤4中，采用限制性内切酶SalI将BAC级载体pCC1BAC线性化；和/或
7.一种用于基于Gibson组装的IGHV区基因座组装的特异性PCR引物，其特征在于，所述特异性PCR引物从5’至3’具有如下结构：
8.根据权利要求8所述的特异性PCR引物，其特征在于，所述特异性PCR引物的序列如SEQ ID No.1-SEQ ID No.30所示。
9.根据权利要求1-6所述制备方法获得的IGHV区基因座。
10.根据权利要求9所述IGHV区基因座在制备多样性的抗体中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种基于gibson组装的ighv区基因座组装方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的基于gibson组装的ighv区基因座组装方法，其特征在于，所述步骤4和步骤5分别如下：
3.根据权利要求1所述的基于gibson组装的ighv区基因座组装方法，其特征在于，所述限制性核酸内切酶选自xbai、xhoi、noti、nhei和i-ceui中1种或2种，更优选地，所述识别序列a对应的是限制性核酸内切酶xbai或xhoi，所述识别序列b对应的是限制性核酸内切酶nhei或sali，所述识别序列c对应的是限制性核酸内切酶noti，所述识别序列d对应的是限制性核酸内切酶i-ceui，所述识别序列e对应的是限制性核酸内切酶xbai或xhoi。
4.根据权利要求1所述的基于gibson组装的ighv区基因座组装方法，其特征在于，所述特异性pcr引物的序列如下所示：
5.根据权利要求1所述的基于gibs...
【专利技术属性】
技术研发人员：宁云山，李海琼，徐舒遥，李妍，
申请(专利权)人：南方医科大学，
类型：发明
国别省市：
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