【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物，具体涉及一种单细胞四重组学文库构建及测序方法。
技术介绍
1、甲基化和dna甲基化研究及其意义：甲基化，尤其是dna甲基化，是当前疾病研究中的一个重要领域，因为它与基因表达和表型变化密切相关。dna甲基化指的是在dna甲基转移酶(dmt)的作用下，将甲基从s-腺苷甲硫氨酸(sam)转移到特定碱基的过程。此过程可以发生在腺嘌呤的n-6位、鸟嘌呤的n-7位和胞嘧啶的c-5位等位置。
2、在哺乳动物中，dna甲基化主要集中在5’-cpg-3’序列的胞嘧啶上，形成5-甲基胞嘧啶(5mc)。cpg序列在哺乳动物中以两种形式存在：一种是分散的cpg双核苷酸，另一种是高密度聚集的cpg岛。在基因组中，70％到90％的分散cpg会被甲基化，而cpg岛通常保持非甲基化状态，除非在某些特定区域或基因外。cpg岛通常位于转录调控区域，并与56％的人类基因组编码基因相关，因此研究这些区域的甲基化状态尤为重要。同时，dna甲基化与人类的发育、细胞分化、衰老及多种疾病密切相关。特别是cpg岛的甲基化可能影响癌基因的活化，而基因组重复序列的低甲基化可能导致基因组稳定性下降。dna甲基化已经成为遗传学和表观基因组学的重要研究方向。
3、人类基因组分析表明，约有28,890个cpg岛分布在基因组中，通常每1mb的染色体上有5到15个cpg岛，平均每mb约含10.5个。近年来，dna甲基化特征已被用于多种肿瘤的诊断和预后评估。研究表明，dna甲基化模式揭示了癌症的发生和发展机制以及癌症组织中的细胞异质性，为早期检测、预后
4、dna甲基化测序的传统方法主要有3类，每种方法都基于不同的生化原理来检测dna甲基化状态。(1)重亚硫酸氢盐处理法(bisulfate sequencing)是最广泛使用的方法之一。其原理是利用重亚硫酸氢盐能够选择性地将未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶则保持不变。在随后的pcr扩增和测序过程中，原本未甲基化的胞嘧啶会被读取为胸腺嘧啶，而甲基化的胞嘧啶仍被读取为胞嘧啶，从而实现甲基化位点的鉴定。这种方法的优势在于可以提供单碱基分辨率的甲基化信息，但也存在dna损伤和不完全转化的潜在问题。(2)基于甲基化或非甲基化c或cpg dna的特异性结合的方法，主要包括甲基化dna免疫沉淀测序(medip-seq)和甲基化cpg结合域蛋白测序(mbd-seq)。medip-seq利用特异性识别5-甲基胞嘧啶的抗体来富集甲基化dna片段，而mbd-seq则使用甲基cpg结合域蛋白来捕获甲基化dna。这两种方法都能提供全基因组范围内的甲基化概况，但分辨率相对较低，通常在百至千碱基水平。(3)基于甲基化dna对甲基化敏感限制性核酸内切酶阻断作用的方法，如甲基化敏感酶切测序(mre-seq)。这种方法利用某些限制性核酸内切酶只能切割未甲基化的识别位点，而不能切割甲基化位点的特性。通过比较酶切后的dna片段，可以推断出甲基化位点的位置。mre-seq的优势在于可以快速、经济的获得全基因组甲基化信息，但其分辨率受限于所使用的酶的识别位点分布。
5、然而，这些传统方法都对dna起始量有较高要求，通常需要数百纳克到微克级的dna样本，这限制了它们在稀有细胞类型或微量样本中的应用。尽管如此，重亚硫酸氢盐测序仍被认为是dna甲基化分析的金标准，因为它能够提供单碱基水平的分辨率，允许研究者精确地绘制甲基化图谱。这种高分辨率使得研究者能够研究单个cpg位点的甲基化状态，对于理解基因调控和疾病相关的表观遗传变异至关重要。
6、在哺乳动物dna甲基化研究中，cpg和cpg岛的甲基化检测以全基因组重亚硫酸盐测序(wgbs)和简化代表性重亚硫酸盐测序(rrbs)等方法应用最广。全基因组bs(wgbs)技术可以用于研究群体细胞的dna甲基化状态，提供全基因组范围内最全面的甲基化信息。但是由于需要对整个基因组进行测序，所以建库和测序的成本相对较高，特别是在处理大量样本时。这种高成本限制了其在大规模研究中的应用。而简化代表性bs(rrbs)技术是一种基于限制性内切酶消化的选择性富集方法，可以为研究者提供一种经济高效的dna甲基化研究方法。rrbs技术的主要优点是可以富集cpg密集区域，如启动子和cpg岛，同时显著降低测序深度和成本，使得在有限预算内分析更多样本成为可能。然而，wgbs和rrbs技术的共同缺点是它们都需要复杂的样品处理过程，包括dna提取、重亚硫酸盐转化和文库构建等步骤。这些繁琐的操作步骤不仅增加了实验时间，还可能引入技术偏差，因此不便于从头开始的多个细胞样品的中、高通量测序操作。此外，这些方法在处理微量样本时面临挑战，特别是在单细胞水平上，由于dna损失和不完全转化等问题，可能导致基因组覆盖度不均匀和数据质量下降。
7、随着单细胞技术的快速发展，研究人员逐渐将目光转向单细胞水平的dna甲基化分析。这种转变源于对细胞异质性重要性的认识不断深化，以及对高分辨率表观遗传信息需求的增加。为了应对这一挑战，科学家们开发了单细胞全基因组重亚硫酸盐测序(scwgbs)和单细胞简化代表性重亚硫酸盐测序(scrrbs)等技术。这些方法是对传统wgbs和rrbs技术的创新性改进，旨在克服在单细胞水平上进行dna甲基化分析时面临的独特挑战。
8、单细胞dna甲基化测序的主要方法：scwgbs技术是首批实现单细胞水平全基因组甲基化分析的方法之一。它通过优化dna提取、重亚硫酸盐转化和文库构建等步骤，使得从单个细胞中获取全基因组甲基化信息成为可能。scwgbs的主要改进点包括使用微量样本处理技术、提高dna转化和扩增效率，以及采用特殊的测序策略来减少数据偏差。然而，scwgbs仍面临着一些局限性，如高测序成本、基因组覆盖度不均匀以及技术噪音较大等问题。
9、为了解决这些挑战，研究人员开发了scrrbs技术。scrrbs对原始rrbs方法进行了改良，最显著的创新是将样品处理的所有实验步骤整合到单管反应中完成，这一改进大大简化了操作流程，减少了样品损失和污染风险。scrrbs能够以单碱基分辨率提供单个二倍体小鼠或人类细胞内约100万个cpg位点的数字化甲基化信息。虽然相比scwgbs(约370万个cpg位点)，scrrbs覆盖的cpg位点数量较少，但它更好地覆盖了cpg岛——这些区域被认为是dna甲基化信息最丰富的元件。scrrbs的核心原理是利用mspi等特异性限制酶富集基因组dna中的cpg岛位点。经酶切后的dna片段经过重亚硫酸氢盐处理，将未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶，而保留甲基化的胞嘧啶。随后通过pcr扩增，使dna片段达到测序所需的浓度。scrrbs的主要优点在于它在保持高分辨率的同时，显著降低了测序成本和复杂度。这使得研究人员能够在有限的预算内分析更多的单细胞样本，从而更全面地揭示细胞群体中的表观遗传异质性。此外，scrrbs对cpg岛的富集也使得它特别适合于研究与基因调控密切相本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种中通量单细胞四重组学文库的构建方法，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述转录组文库构建包括：
3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述单细胞裂解前使用GpC甲基转移酶对细胞进行体外甲基化处理；
4.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述RNA逆转录的体系中包括TSO引物、RNA标签、逆转录酶、RNase抑制剂、增强剂和缓冲溶液；
5.根据权利要求1～4中任一项所述的构建方法，其特征在于，所述基因组文库构建包括：
6.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于，b)中所述甲基化接头连接的接头序列为两条单链核酸退火后形成的Y型双链结构；
7.根据权利要求6所述的构建方法，其特征在于，所述的细胞为单细胞和/或多细胞样本；
8.一种单细胞四重组学文库，通过权利要求1～7任一项所述的构建方法构建得到。
9.一种测序方法，包括对权利要求8所述的单细胞四重组学文库进行测序的步骤；
10.权利要求1～7任一项所述的构建方法、权利要求9所
...【技术特征摘要】
1.一种中通量单细胞四重组学文库的构建方法，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述转录组文库构建包括：
3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述单细胞裂解前使用gpc甲基转移酶对细胞进行体外甲基化处理；
4.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述rna逆转录的体系中包括tso引物、rna标签、逆转录酶、rnase抑制剂、增强剂和缓冲溶液；
5.根据权利要求1～4中任一项所述的构建方法，其特征在于，所述基因组文库构建包括：<...
【专利技术属性】
技术研发人员：李琳，王智浩，徐敏，彭俊华，江嘉楠，
申请(专利权)人：南方医科大学，
类型：发明
国别省市：
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