体外血液动力学的内皮／平滑肌细胞共培养模型在鉴定血管疾病的新型治疗靶标中的应用制造技术

本发明专利技术涉及用于将人体循环模型化后的血液动力学（即血流）模式施加于培养中的人类／动物细胞的体外生物机械模型。这一模型复现了使用非侵入式磁共振成像从人体循环直接测量的并且翻译给控制椎台转动的马达的血液动力学流模式。椎台浸入流体（即细胞培养基）中并且达到密切接近在平板表面生长的细胞表面。椎台的转动将动量传感到流体上并且在平板或细胞表面产生依时间变化的剪切应力。这一模型最接近地模拟了体内施加于内皮细胞（血管内衬的细胞）的生理血液动力学力并且克服了早前应用更简化的非生理流动式的流装置的局限性。本发明专利技术的另一方面涉及结合Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ的共培养皿。这允许在培养皿环境下物理分离两种、三种或更多种不同细胞类型，同时将内部的细胞表面暴露于模拟的血液动力学流模式。其他重要的改变包括定制的流入和流出管道以向共培养模型的内和外室两者分别且独立地供给培养基、药物等。使用外部组件来控制生理温度和气体浓度。通过人工Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ膜以及Ｐｅｔｒｉ皿的底部的贴壁细胞的物理分离允许分别地分离每个细胞层、或表面用于生物分析阵列（即蛋白质、基因等）。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】体外血液动力学的内皮/平滑肌细胞共培养模型在鉴定血管疾病的新型治疗靶标中的应用相关申请的交叉引用本申请根据35U.S.C.§119(e)主张2007年1月10日递交的美国临时专利申请No.60/879,710的优先权，其在此通过引用作为参考。关于资助研究或开发的声明不适用。序列表的引用不适用。专利技术背景专利
本专利技术通常涉及用于体外分析细胞(例如，内皮细胞)上流体流动(例如，血液动力学)的装置和方法。更具体地，本专利技术涉及使用允许在培养皿环境内物理分开一种以上的不同细胞类型，同时内部的细胞表面暴露于模拟的血液动力学流模式的装置的方法。相关技术的说明动脉粥样硬化是由动脉损害形成以及管腔变窄为特征的血管炎性疾病。内皮细胞(EC)和平滑肌细胞(SMC)局部(regional)表型在血管疾病进展中具有显著的影响。早期动脉粥样化形成期间，内皮变得活化，导致粘附分子表达，对脂蛋白的通透性以及细胞因子产生的增加。此种环境改变可以影响SMC以经历“表型转换”，该表型转换特征为形态的改变、提高的增殖和迁移、以及降低的确定的静止SMC标记的表达。动脉粥样硬化进一步的特征为其在大动脉中于血液动力学上受限(defined)的区域处形成斑块，例如在产生复杂流动模式的分叉处形成斑块。对空斑形成敏感的倾向于动脉硬化的(Atheroprone)区域经受低时均(timeaveraged)剪切应力和“干扰的”振荡流模式。相反，对空斑形成不很敏感的防止动脉硬化的(atheroprotective)区域遭受相对较高的时均剪切应力和脉动层流(13，39)。血流长期受干扰的区域中，EC表型的变化，例如增加的粘附分子表达(即血管细胞粘附分子1(VCAM-1)、细胞间粘附分子1(ICAM-1)、e-选择蛋白)，和对于低密度脂蛋白(LDL)的穿内皮通透性，将影响局部信号环境并且可以改变SMC表型，导致动脉粥样硬化的增生、迁移和发病。对于涉及EC和血液动力学流模式的控制SMC表型改变的因素并未全面理解。然而，动脉粥样硬化中SMC表型转换的标志是限定分化的SMC的收缩蛋白质的遏制，包括SMMHC、SMαA和myocardin。为了理解动脉粥样化形成中剪切应力对内皮的作用，广泛地研究了将EC暴露于多种剪切应力条件的体外模型。由于EC可以辨别流模式中的变化并且对于剪切应力幅度和血液动力学的时间变化特征敏感，仿效体内流环境似乎对于概括内皮的体内表型具有更大影响。此外，很少有研究显示了在任何模式的流存在下，EC和SMC的复杂的相互作用和交叉通讯，并且目前尚无已知的调查关于内皮上的体内来源的人血液动力学力如何调控SMC表型转换的研究，所述转换正如典型地由文献所定义的。专利技术概述本专利技术的一方面涉及(但不限于)用于将在人体循环模型化后的血液动力学(即血流)模式施加于培养中的人类/动物细胞的体外生物机械模型。这一模型复现使用非侵入式磁共振成像从人体循环直接测量的并且翻译给控制椎台(cone)转动的马达的血液动力学流模式。椎台浸入流体(即细胞培养基)中并且达到非常接近平板表面上生长的细胞表面。椎台的转动将动量传递到流体上并且在平板或细胞表面产生依时间变化的剪切应力。该模型最接近地模拟了体内施加于内皮细胞(血管内衬的细胞)的生理血液动力学力并且克服了早前应用更简化的非生理流动模式的流动装置的局限性。本专利技术的另一方面涉及结合市售可得的transwell的共培养皿，例如75mm直径的transwell。这允许在培养皿环境下物理分开两种、三种或更多种不同细胞类型，同时将内部的细胞表面暴露于模拟的血液动力学流模式。其他重要的改变包括流入和流出管道以向共培养模型的内和外室两者分别且独立地供给培养基、药物等。使用外部组件来控制生理温度和气体浓度。贴壁细胞通过人工transwell膜以及Petri皿的底部的物理分离允许分别地分离每个细胞层、或表面用于生物分析阵列(即蛋白质、基因等)。本专利技术的直接应用包括1)研究人类/动物内皮和平滑肌细胞的交叉对话，这两种细胞是构成血管壁并参与动脉粥样硬化(心脏病、中风、外周血管疾病)和其他血管疾病的病理进展的两种关键细胞类型。2)这一模型也可用作诊断模型，检测新型基于药物的治疗的毒性、炎症(例如单核细胞粘附、炎性细胞因子释放、炎性基因诱导)和通透性。涉及本专利技术的多种实施方案的一些示例性新方面包括但不限于下述(没有指定的顺序)：该装置可以以最高水平的保真性来复现在对动脉粥样硬化敏感和有防御性的动脉循环中以及来自对其他生理(例如锻炼)或病理状况(例如高血压、糖尿病、血脂异常)敏感的患者的血液动力学剪切应力谱。该装置可以以最高水平的保真性来复现来自动脉、静脉或任何器官循环的任何类型的可测量的或理想的剪切应力谱。在transwell膜的反面上培养有或者无另一种类型细胞的情况下，将血液动力学流模式暴露于transwell膜的内表面上。在transwell皿的底表面上培养有或者无另一种类型细胞的情况下，将血液动力学流模式暴露在transwell膜的内表面上。在transwell膜的反面上培养有或者无另一种类型细胞以及在transwell皿的底表面上培养有或者无第三种类型细胞的情况下，将血液动力学流模式暴露在transwell膜的内表面上。该第三种细胞可包括用于炎性细胞粘附检测的单核细胞或巨噬细胞。在transwell膜的反面上培养有或者无另一种类型细胞以及在transwell膜的内表面的培养基中悬浮有或者无第三种类型细胞的情况下，将血液动力学流模式暴露在transwell膜的内表面上。使用装在transwell侧部的夹子将用于内(上)室和外(下)室两者的流入和流出管道固定在原位上。使用该管道来分别地向transwell的上和/或下室灌注培养基、生化化合物、激动剂、拮抗剂等和使其流出而不扰乱流动环境。可以使用由该实验取出的培养基来进一步检测来自每层的细胞因子或体液因子分泌。从单个实验独立地分离每种细胞类型(所用的一种、两种或三种不同细胞类型)用于在后加工的生物(蛋白质组/基因组)分析(包括基因阵列、蛋白质组学)的能力。该装置可以接受并检测来自物种的无论贴壁或非贴壁的任何细胞类型。该装置可以用作血管生物模拟细胞培养模型用于调查从胚胎血管发育到成人严重的动脉粥样硬化情形的所有阶段。例如，可将内皮细胞在transwell膜的内表面铺板接种和/或将平滑肌细胞在transwell膜反面铺板接种和/或将巨噬细胞(或白细胞)接种在上或下室中。该装置可以用于检测在血液动力学条件下来自血管支架材料的细胞的兼容性、细胞粘附、以及表型调节。例如，可将内皮和/或平滑肌细胞紧邻该材料、在该材料上部、或在该材料下面接种，该材料安装在装置的固定的表面上。材料包括但不限于金属纳米多孔(nanoporous)金属、聚合物、生物可降解聚合物、碳表面、刮擦或蚀刻了的表面。该装置可以用于检测在血液动力学条件下从细胞存在或不存在的血管支架材料洗脱的药物(即化合物)。该装置可以用于检测在血液动力学条件下由聚合材料包覆的表面上或其附近接种的细胞的兼容性、细胞粘附性、和表型调节。该装置可以用作血管生物模拟细胞培养模型用于调查血-脑屏障。例如，可将内皮细胞在transwell膜的内表面铺板接种和/或将神经胶本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于向培养中的细胞施加血液动力学模式的方法，所述方法包括步骤：　将第一组细胞在Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ上铺板接种；　将第二组细胞在所述Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ上铺板接种，其中所述第一组细胞与所述第二组细胞分开；　向所述Ｔｒａｎｓｗ ｅｌｌ中加入流体；　造成所述流体旋转一段时间，其中所述培养基因此对所述第二组细胞施加剪应力。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】US 2007-1-10 60/879,7101.在细胞培养期间模拟血液动力学流的方法，所述方法包括步骤：向petri皿中加入培养基；将第一种类型的细胞在多孔膜的第一面铺板接种；将第二种类型的细胞在多孔膜的第二面铺板接种，其中所述petri皿包含含有第一种类型的细胞的外室和含有第二种类型的细胞的内室；将培养基灌注进和灌注出内室；将培养基灌注进和灌注出外室；向被铺板的第二种类型的细胞施加剪切应力，所述剪切应力由血液动力学流装置的旋转椎台引起的培养基的流产生，所述流模拟了血液动力学流；其中所述方法不包括任何疾病或健康状况的诊断。2.权利要求1的方法，其中加入petri皿的培养基包括药物或化合物；其中灌注进和灌注出内室的培养基包括药物或化合物；或其中灌注进和灌注出外室的培养基包括药物或化合物。3.在细胞培养期间模拟血液动力学流的方法，所述方法包括：将血液动力学模式模型化成一组电指令；向petri皿加入培养基；将第一种类型的细胞在多孔膜的第一面铺板接种；将第二种类型的细胞在多孔膜的第二面铺板接种，其中所述petri皿包含含有第一种类型的细胞的外室和含有第二种类型的细胞的内室；将培养基灌注进和灌注出内室；将培养基灌注进和灌注出外室；基于该组电指令，使用装置向浸在培养基中的被铺板的第二种类型的细胞施加剪切应力，所述剪切应力由培养基的血液动力学流产生，其中所述血液动力学流由血液动力学流装置的旋转椎台引起；其中所述方法不包括任何疾病或健康状况的诊断。4.权利要求1-3中任一项的方法，还包括培养所有类型的细胞的步骤。5.权利要求1-3中任一项的方法，其中第一种类型的细胞是平滑肌细胞、神经胶质细胞、星形细胞、神经元、上皮足细胞并且第二种类型的细胞是内皮细胞。6.权利要求1-3中任一项的方法，其中第一种类型的细胞和第二种类型的细胞的至少一种是来自一个或者多个患者之血管的细胞或器官的细胞，所述患者具有与药物毒性相联系的经鉴定的基因型。7.权利要求6的方法，其中所述的一个或者多个患者具有与药物毒性相联系的单核苷酸多态性。8.权利要求1-3中任一项的方法，其中血液动力学流源自之前测量的血液动力学模式。9.权利要求8的方法，其中所述的之前测量的血液动力学模式是人来源的。10.权利要求8的方法，其中血液动力学模式来自动脉、静脉或者器官。11.权利要求8的方法，其中所述模式源自具有病理状态的患者。12.权利要求1-3中任一项的方法，其中所述血液动力学流是依时间变化的。13.权利要求1的方法还包括：将血液动力学模式模型化成一组电指令；基于该组电指令，向被铺板的第二种类型的细胞施加剪切应力。14.权利要求3或者13的方法，其中所述血液动力学模式来自超声数据的分析。15.权利要求3或者13的方法，其中所述血液动力学模式来自磁共振成像(MRI)数据的分析。16.权利要求3或者13的方法，其中所述血液动力学模式是依时间变化的。17.权利要求3或者13的方法，其中该组电指令被血液动力学流装置的电控制器接受，电控制器操作装置的马达，以及马达使得与所述马达相连的椎台转动，其中所述椎台的转动导致培养基的所述流。18.权利要求2的方法，其中当施加所述剪切应力时或者在施加剪切应力之前将药物或者化合物加入培养基中。19.权利要求2的方法，其中药物或化合物选自PDGF抑制剂、rho激酶抑制剂、合成的多糖、抗再狭窄剂、...

【专利技术属性】
技术研发人员：B布莱克曼，B瓦姆霍夫，
申请(专利权)人：海莫希尔有限责任公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]