【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于二代基因测序，具体涉及一种基于ngs的肠道病毒全基因组检测方法及其应用。
技术介绍
1、肠道病毒(enterovirus，ev)属于小rna病毒科，基因组是一条单链rna分子，全长约7.5～8.4kb，由病毒编码的正二十面体蛋白质外壳包裹。肠道病毒是重要的人类病原微生物，在历史上曾引起广泛人群健康问题的脊髓灰质炎病毒(poliovirus)、柯萨奇病毒(coxsackievirus)、致肠细胞病变人孤儿病毒(echovirus)等都属于肠道病毒。因此，快速、准确且早期的对肠道病毒进行检测对于患者救治具有非常重要的临床价值。
2、最新的分子生物学研究进展将肠道病毒分为abcd四个类别，至少116种亚型。不同类别、不同亚型的肠道病毒基因组有一定的相似性但不同之处更多。另外肠道病毒本身作为rna病毒，基因组序列变异快。伴随着肠道病毒流行趋势的快速变化以及新型肠道病毒鉴定的需求，传统的血清学、qpcr等方法已不能满足当前的需要，亟需一种能在未知肠道病毒型别等分子特征的情况下直接检测其全基因组序列的技术。
3、基于二代测序(next-generation sequencing，ngs)的全基因组测序方法可覆盖病毒序列全长，弥补了常规方法只可检测少量已知区域的缺点，不但能提高检测准确性，还能对病毒可能的变异进行鉴别。基于此，本专利技术提供一种基于ngs进行肠道病毒全基因组检测的方法，所述方法检测效率高，灵敏度好，适用于所有肠道病毒，在无需事先了解病毒样本的类别和亚型的前提下获得肠道病毒除收尾各约20bp
技术实现思路
1、本专利技术的一个目的是提供一种引物及其在肠道病毒全基因组检测中的应用，所述引物包括特异性逆转录引物和特异性pcr扩增引物；本专利技术的第二个目的是提供一种包含所述引物的试剂盒，所述试剂盒用于对肠道病毒进行全基因组检测；本专利技术第三个目的是提供一种非疾病诊断和治疗目的的肠道病毒全基因检测方法；本专利技术还有一个目的是提供一种基于ngs进行肠道病毒全基因检测的文库构建方法。
2、若没有特别说明，本专利技术技术方案中所述的肠道病毒包括所有的目前已知的a、b、c、d四类肠道病毒。
3、本专利技术的目的通过如下技术方案实现：
4、第一方面，本专利技术提供一种特异性逆转录引物，所述引物用于对肠道病毒进行逆转录获得cdna，其特征在于，所述特异性逆转录引物由表1中seq id no.1-4所示的核苷酸组成。
5、本专利技术提供的特异性逆转录引物是根据肠道病毒一致性序列设计得到的基因特异性引物，所述引物选择性的逆转录病毒的rna，实现对病毒rna的特异性富集，能够提高测序数据中病毒序列的占比。
6、第二方面，本专利技术提供一种特异性pcr扩增引物，其特征在于，所述引物包括引物组1和引物组2，其中，所述引物组1由表2中seq id no.5-10所示的核苷酸组成，所述引物组2由表3中seq id no.11-16所示的核苷酸组成。
7、本专利技术提供的引物组1可以肠道病毒cdna为模板，扩增得到约4.5kb的核酸片段，其中seq id no.5-6所示的核苷酸为上游引物，seq id no.7-10所示的核苷酸为下游引物。
8、本专利技术提供的引物组2可以病毒cdna为模板，扩增得到约3kb的核酸片段，其中seqid no.11-12所示的核苷酸为上游引物，seq id no.13-16所示的核苷酸为下游引物。
9、在本专利技术的一个具体实施方式中，所述引物组1和引物组2分两管，分别以病毒cdna为模板进行单独扩增。
10、在本专利技术的一个具体实施方式中，所述引物组1和引物组2合并为一管，以病毒cdna为模板进行单管扩增。
11、优选的实施方式为，将引物组1和引物组2混合，进行单管扩增，提高效率，减少样本交叉污染，有利于节省成本。
12、第三方面，本专利技术提供一种本专利技术第一方面所述的特异性逆转录引物和/或第二方面所述的特异性pcr扩增引物在如下至少一项中的应用：
13、1)在制备用于肠道病毒基因靶向富集的产品中的应用；
14、2)在制备用于肠道病毒多重扩增的产品中的应用；
15、3)在制备用于肠道病毒基因组测序基因文库构建的产品中的应用；
16、4)在制备用于肠道病毒全基因组检测的产品中的应用。
17、所述产品包括但不限于试剂、试剂盒、芯片、试纸、膜条或检测平台中的一种。
18、第四方面，本专利技术提供一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括本专利技术第一方面所述的特异性逆转录引物和/或第二方面所述的特异性pcr扩增引物。
19、优选的，所述试剂盒中还包括在逆转录、pcr扩增及纯化过程中本领域技术人员常规使用的任何试剂，所述试剂包括但不限于逆转录酶、聚合酶、缓冲液、mg2+、dntps、纯化磁珠、无核酸酶水，所述试剂均可通过市售途径获得。
20、进一步的，所述试剂盒中还包括用于基因文库构建的本领域技术人员常规使用的任何试剂，所述试剂包括但不限于片段化酶、末端修复酶、dna连接酶、特异性接头、缓冲液，所述试剂均可通过市售途径获得。
21、第五方面，本专利技术提供一种不以疾病诊断和治疗为目的的肠道病毒全基因组检测方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
22、s1：提取待检样本rna；
23、s2：以步骤s1获得的rna为模板，加入本专利技术第一方面所述的特异性逆转录引物，逆转录获得cdna；
24、s3：以步骤s2所述cdna为模板，加入本专利技术第二方面所述的特异性pcr扩增引物，扩增、纯化、产物片段化、加接头，得到测序文库；
25、s4：纯化文库；
26、s5：文库质控；
27、s6：上机测序；
28、s7：生信分析。
29、第六方面，本专利技术提供一种基于ngs进行肠道病毒全基因检测的文库构建方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
30、s1：提取待检样本rna；
31、s2：以步骤s1获得的rna为模板，加入本专利技术第一方面所述的特异性逆转录引物，逆转录获得cdna；
32、s3：以步骤s2所述cdna为模板，加入本专利技术第二方面所述的特异性pcr扩增引物，扩增、纯化、产物片段化、加接头，获得测序文库。
33、根据本专利技术第五方面和第六方面所述，其中，待检样本为任何可能含有肠道病毒的物质，包括但不限于食品、粪便、口腔拭子、肛拭子、组织、全血、唾液。
34、在本专利技术的具体实施方式中，所述步骤s2中逆转录条件为：
35、 温度 时间 本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种特异性逆转录引物，所述引物用于对肠道病毒进行逆转录获得cDNA，其特征在于，所述特异性逆转录引物由表1中SEQ ID NO.1-4所示的核苷酸组成。
2.一种特异性PCR扩增引物，其特征在于，所述引物包括引物组1和引物组2，其中，所述引物组1由表2中SEQ ID NO.5-10所示的核苷酸组成，所述引物组2由表3中SEQ ID NO.11-16所示的核苷酸组成。
3.根据权利要求2所述的特异性PCR扩增引物，其特征在于，引物组1中的SEQ ID NO.5-6所示的核苷酸为上游引物，SEQ ID NO.7-10所示的核苷酸为下游引物；引物组2中的SEQID NO.11-12所示的核苷酸为上游引物，SEQ ID NO.13-16所示的核苷酸为下游引物。
4.权利要求1所述的特异性逆转录引物和/或权利要求2-3任一项所述的特异性PCR扩增引物在如下至少一项中的应用：
5.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括权利要求1所述的特异性逆转录引物和/或权利要求2-3任一所述的特异性PCR扩增引物。
6.根据权利要求5所述的
7.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括用于基因文库构建的本领域技术人员常规使用的任何试剂，所述试剂包括片段化酶、末端修复酶、DNA连接酶、特异性接头或缓冲液。
8.一种不以疾病诊断和治疗为目的的肠道病毒全基因组检测方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
9.一种基于NGS进行肠道病毒全基因检测的文库构建方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述待检样本为任何可能含有肠道病毒的物质，包括食品、粪便、口腔拭子、肛拭子、组织、全血、唾液。
...【技术特征摘要】
1.一种特异性逆转录引物，所述引物用于对肠道病毒进行逆转录获得cdna，其特征在于，所述特异性逆转录引物由表1中seq id no.1-4所示的核苷酸组成。
2.一种特异性pcr扩增引物，其特征在于，所述引物包括引物组1和引物组2，其中，所述引物组1由表2中seq id no.5-10所示的核苷酸组成，所述引物组2由表3中seq id no.11-16所示的核苷酸组成。
3.根据权利要求2所述的特异性pcr扩增引物，其特征在于，引物组1中的seq id no.5-6所示的核苷酸为上游引物，seq id no.7-10所示的核苷酸为下游引物；引物组2中的seqid no.11-12所示的核苷酸为上游引物，seq id no.13-16所示的核苷酸为下游引物。
4.权利要求1所述的特异性逆转录引物和/或权利要求2-3任一项所述的特异性pcr扩增引物在如下至少一项中的应用：
5.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包...
【专利技术属性】
技术研发人员：宋钢，王朝晖，王强，
申请(专利权)人：上海真固生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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