本发明专利技术涉及一种重组疟疾疫苗及其制备方法。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及一种重组疟疾疫苗及其制备方法。
技术介绍
疟原虫(疟原虫属(尸/"，o&画))的裂殖子表面蛋白(MSP-l)存在于裂殖子 表面上，其为疟原虫的红细胞侵入形式。MSP-1以分子量约为190kDa的前 体蛋白的形式被生产出来，其在裂殖子成熟过程中被蛋白酶解加工成称为 p83、 p30、 p38和p42的四种片段，这四种片段以非共价连接的形式保留在 寄生虫的表面。在侵入红细胞时，发生进一步的蛋白酶剪切。MSP-1蛋白由几个高度保守区、二形区(dimorphic region)组成，该二形 区与在N末端区域中的两个等位形式之一和两个相对较小的少数发育型区组 (oligomorphic block)之一有关(Tanabe等人，J. Mol. Biol. 195 (1987) 273-287; Miller等人,Mol. Biochem. Parasitol. 59 (1993), 1-14;在此通过引用方式将其 并入本申请)。已证实MSP-1蛋白是可能的疫苗候选(Holder禾P Freeman, Nature 294 (1981), 361-364; Majarian等人，J. Immunol" 132 (1984)， 3131-3137)。此外，已 经在灵长类动物(特别是夜猴(Aotus)和松鼠猴(Saimid monkey))上使用来自恶 性疟原虫(尸/fl/cz》aram)的MSP-1材料进行了一些疫苗接种研究(例如Perrin 等人，J. Exp. Med. 160 (1984), 441-451 ; Hall等人，Nature 311 (1984) 379-382; Siddiqui等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 (1987), 3014-3018; Ettlinger等人, Inf. Imm. 59 (1991), 3498-3503; Holder等人，Parasite Immunol. 10 (1988)， 607-617; Herrera等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 (1990), 4017-4021; Herrera等人，Inf. Imm. 60 (1992), 154-158以及Patarroyo等人，Nature 328 (1987)， 629-632,在此通过引用方式将其并入本申请)。使用来自大肠杆菌(￡."//)的MSP-1蛋白的重叠重组片段进行的疫苗接 种研究表明具有保护效果(Tolle等人，Infect. Immun. 61 (1993)， 40-47)。在施用 p19或p42多肽形式的MSP-1蛋白的C末端区域之后，也发现了保护效果 (Chang等人，Inf. Imm. 64 (1996), 253-261)。WO 98/14583描述了 一种通过与天然产生的序列相比减少所表达的 DNA序列中的AT含量来制备重组的完整MSP-1多肽的方法。但是，WO 98/14583中所述的方法存在一些缺点。首先，该制备方法仅在N和/或C末 端序列标志存在下才能有效纯化。其次，纯化方法仅在小规模时有效。适应 于疫苗制备的工业过程中所需的大规模纯化方法是不容易得到的。Kauth等人描述了来自异源产生的亚单位的恶性疟原虫株系3D7 /a/c/parwm strain 3D7)的MSP-1多肽的体外重建(J. Biol. Chem. 278 (2003)， 22257-22264)。但是，其中仅描述了与异源序列标签(如GST、链球菌或六 组氨酸标签)融合的多肽的纯化。但是，在疫苗中，这种异源序列的存在是 不合需要的。
技术实现思路
本专利技术通过提供一种组合物克服了现有技术的缺点，该组合物包含(a) 没有异源序列的来自疟原虫属的gpl90/MSP-l蛋白的纯化片段 p83/30，和(b) 没有异源序列的来自疟原虫属的gpl90/MSP-l蛋白的纯化片段 p38/42。优选地，纯化的p83/30片段为F-片段，即源自疟原虫属F株的片段，尤 其是源自恶性疟原虫株系FCB-1(也称为FC或F)的片段。令人惊讶地发现， 与D-片段(即源自疟原虫属D株的片段，尤其是源自恶性疟原虫株系3D7(也6称为NF54)的片段)相比，F-片段在对抗蛋白酶解上更稳定。此外，令人惊讶 地发现，p38/30 F-片段可以与异源和/或同源p38/42片段组合，例如与异源 p38/42 D-片段和/或p38/42 F-片段组合。在本专利技术的组合物中，成分(a)和(b)优选以大约等摩尔的量存在，例如， 成分(a)与成分(b)的摩尔比为1.5:1 1:1.5，更优选L2:l l:1.2且最优选大约 1:1。优选地，在组合物中的至少70%、更优选至少80%且最优选至少90%片 段以非共价连接的二聚体的形式存在。成分(a)和(b)优选为重组多肽，即在如真核宿主细胞(如酵母细胞，例如 S. ce v/s/ae或/3 paeon's)或者如原核细胞(如革兰氏阴性菌细胞，例如大 肠杆菌)的重组宿主细胞中己制备的多肽。优选地，重组宿主细胞为大肠杆 菌细胞。更优选地，宿主细胞为大肠杆菌W3110Z2。在--个优选的实施方式中，如通过SDS凝胶电泳和银染色所测定，本发 明的组合物的纯度为至少95%和95%以上，优选至少97.5°/。。在本文中，术 语"纯度"指没有异源多肽(即非MSP-1多肽)。在另一个进一步的优选实施方式中，如通过SDS凝胶电泳和免疫染色所 测量，所述组合物的降解产物的含量小于30%，更优选小于20%,且最优选 小于10%。在本文中，术语"降解产物"指由如上所述的p83/30片段或p38/42 片段降解产生的多肽分子。本专利技术的组合物包含来自疟原虫属的gpl90/MSP-l蛋白的纯化片段 p83/30和来自疟原虫属的gpl90/MSP-l蛋白的纯化片段p38/42。术语"p83/30 片段"指包含疟原虫属的MSP-1蛋白的p83片段和p30片段的单个多肽。优 选地，所述组合物包含来自疟原虫属F株的p83/30片段。p38/42片段为包含 来自疟原虫属的MSP-1蛋白的p38片段和p42片段的单个多肽。p38/42片段 可源自任何疟原虫属株系，例如恶性疟原虫的D株或F株。7p83/30片段优选包含如SEQ ID NO:l中所示的恶性疟原虫F株的氨基酸 序列和非必需的N-末端信号肽序列或源自F株序列的修饰的F-片段。在较不 优选的实施方式中，p83/30片段包含恶性疟原虫D株的氨基酸序列和非必需 的N-末端信号肽序列或修饰的D株序列。SEQIDNO:2中所示的氨基酸序列 源自D株的氨基酸序列并且包含在第611位(E — K)和第866位(Q — H)的2 个氨基酸置换。p38/42片段可源自恶性疟原虫F株，如SEQ ID NO:3中所示，和/或源 自恶性疟原虫D株，如SEQ IDNO:4中所示。令人惊讶地发现，F株的p83/30 片段既可与来自F株的同源p38/42片段组合，又可与来自不同恶性疟原虫株 系(例如D株)的异源p38/42片段组合。术语"p83/30片段"和"p38/42片段"也指在多肽的全长范围内与天然 p83/30或p38/4本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种组合物，其包含： （ａ）没有异源序列的来自疟原虫属的ｇｐ１９０／ＭＳＰ－１蛋白的纯化片段ｐ８３／３０；和 （ｂ）没有异源序列的来自疟原虫属的ｇｐ１９０／ＭＳＰ－１蛋白的纯化片段ｐ３８／４２。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：赫尔曼比雅尔，罗尔夫卢茨，克里斯琴考思，克里斯琴埃普，乌特沃尔比尔，
申请(专利权)人：赫尔曼比雅尔，
类型：发明
国别省市：DE[德国]
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