基因编辑及微同源末端连接联合的大片段DNA定点整合方法技术

本发明专利技术公开了基因编辑技术及微同源末端连接联合介导的大片段DNA高效定点整合的方法。本发明专利技术利用分别携带包含基因编辑表达框的载体和包含微同源末端序列的供体载体的农杆菌共转化植物，在对植物靶基因进行编辑的同时定点插入外源DNA片段，由于微同源序列末端的存在，使得外源DNA片段与基因组双链断裂末端更易发生微同源序列介导的末端连接，从而实现外源DNA片段定点整合入植物基因组中。本发明专利技术提供的方法具有精准、高效、整合片段大等优点，极大地减少了遗传转化、目标株系筛选和边际序列分析等工作量，在分子医药农业和作物种质改良领域具有重要的应用价值。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及农业生物，具体为基因编辑及微同源末端连接联合的大片段dna定点整合方法。

技术介绍

1、crispr-cas9是继zfn、talens等基因编辑技术后发现的第三代基因编辑技术，是现有基因编辑和修饰技术中效率最高、最简便、成本最低、最容易的技术之一，已成为主流应用的基因编辑系统。上述基因编辑技术通常都会在基因组形成双链断裂(dsb)，通常细胞发生dsb后，激活自身两种dna修复机制——非同源末端连接(non-homologousendjoining，nhej)和同源重组介导修复(homology directed repair，hdr)。最近的研究发现还存在一种微同源序列连接的方式介导dna修复(microhomology-mediated endjoining，mmej)(vu，et al.“crispr/cas-based precision genome editing viamicrohomology-mediated end joining.”plant biotechnology journal(2020)。p>

2、基因组本文档来自技高网...

【技术保护点】

1.针对水稻谷蛋白GluA1和GluA2的高效基因编辑共用靶点，序列如SEQ ID NO：1和SEQID NO：2所示。

2.一种高效的GluA1/2基因编辑转基因筛选双元载体，其特征在于，所述基因编辑载体的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。

3.根据权利要求1所述的高效的GluA1/2基因编辑转基因筛选双元载体，其特征在于：包括抗潮霉素基因、红色荧光基因、sgRNA表达盒和Cas9基因。其特征在于，所述sgRNA表达盒由水稻U6a启动子驱动，其靶点序列如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示；所述Cas9蛋白由玉米ubiqintin启动子驱动。...

【技术特征摘要】

1.针对水稻谷蛋白glua1和glua2的高效基因编辑共用靶点，序列如seq id no：1和seqid no：2所示。

2.一种高效的glua1/2基因编辑转基因筛选双元载体，其特征在于，所述基因编辑载体的核苷酸序列如seq id no：3所示。

3.根据权利要求1所述的高效的glua1/2基因编辑转基因筛选双元载体，其特征在于：包括抗潮霉素基因、红色荧光基因、sgrna表达盒和cas9基因。其特征在于，所述sgrna表达盒由水稻u6a启动子驱动，其靶点序列如seq id no：1和seq id no：2所示；所述cas9蛋白由玉米ubiqintin启动子驱动。

4.根据权利要求2所述的高效的glua1/2转基因筛选双元载体，其特征在于，所述载体的核苷酸序列如seq id no：5所示。

5.一种末端包含微同源序列的供体基因序列，包括抗草甘膦抗性基因、绿色荧光基因、供体基因表达盒，供体基因表达盒为禽流感h5n6血凝素蛋白h5基因，序列如seq id no：4所示。

6.一种外源dna片段定点整合入水稻基因组的方法，其特征在于，具体包括以下步骤：

7.根据权利要求6所述的外源dna片段定点整合入水稻基因组的方法，其特征在于：所述农杆菌浓度为od600在0.4-0.6之间。

【专利技术属性】
技术研发人员：欧阳超，庞建磊，宋喻鑫睿，
申请(专利权)人：杭州珈禾万欣生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：