【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于电化学发光生物传感，具体涉及一种测定凝血酶活性的微型电化学发光生物传感器、制备方法及其应用。
技术介绍
1、凝血酶活性检测对于评估患者的凝血功能以及诊断和监测血液疾病至关重要，可帮助医生诊断各种凝血障碍，如出血病、血栓症、凝血因子缺乏或异常等。手术前，医生通常会进行凝血酶活性检测，以确保患者的凝血功能正常，这有助于预防术中或术后出血的风险。由于某些药物(如抗凝剂和抗血小板药物)会影响凝血酶的活性，定期检测可以确保患者在药物治疗期间保持适当的凝血状态。对于患有凝血疾病的患者，定期检测凝血酶活性有助于监测疾病的进展和治疗效果。总之，凝血酶活性检测在临床实践中具有重要作用，有助于确保患者的凝血功能处于正常状态，从而维护健康和预防并发症。目前临床上普遍通过凝血四项(包括凝血酶原时间(pt)、活化部分凝血活酶时间(aptt)、凝血酶时间(tt)、纤维蛋白原(fib))来判定体内凝血或出血的情况，并不能直接反映出凝血酶的活性。
2、文献已报道不少关于凝血酶测定方法的研究，例如比色法、荧光分析法(fl)、生物发光共振能量转移(bret)、表面增强拉曼散射(sers)技术、电化学分析技术(ec)等，这些测定技术大多基于适配体进行测定，只能反映出凝血酶的数量，无法识别凝血酶的“活性”，因此，不能作为凝血酶活性判断的方法。
3、凝血酶的活性需要基于凝血酶特异性肽段识别作用，通过剪切底物肽段的效果来反应。电化学发光法是一种结合了电化学与化学发光的分析方法。当凝血酶作用于电化学发光标记的底物时，会引起发光信号的变化
技术实现思路
1、为了克服上述现有技术的缺点，本专利技术的目的在于提供一种测定凝血酶活性的微型电化学发光生物传感器、制备方法及其应用，用以解决现有检测仪器体积大、无法检测凝血酶活性、检测过程复杂以及稳定性不易控制的技术问题。
2、为了达到上述目的，本专利技术采用以下技术方案予以实现：
3、本专利技术的第一个方面，公开了一种测定凝血酶活性的微型电化学发光生物传感器，包括spe电极，所述spe电极上依次固定有三联吡啶钌、金和凝血酶特异性肽段，spe电极表面的空白位点均被封闭；
4、其中，所述凝血酶特异性肽段为连接有二茂铁，且肽键能够被凝血酶切割的肽段。
5、优选地，所述凝血酶特异性肽段为mpr-ggrk(fc)、mpr-vprk(fc)、mpr-d(obzl)prk(fc)或mpr-fprk(fc)；
6、所述凝血酶特异性肽段的合成方法为：将mpr偶联树脂，然后依次将对应的氨基酸添加到树脂已固定的mpr上，再将二茂铁甲酸转化为相应的酰氯后，连接于氨基酸末端，得到凝血酶特异性肽段。
7、进一步优选地，所述凝血酶特异性肽段为mpr-ggrk(fc)。
8、优选地，三联吡啶钌通过全氟化树脂膜固定于spe电极上。
9、优选地，spe电极表面的空白位点均封闭有巯基己醇。
10、本专利技术的第二个方面，公开了上述测定凝血酶活性的微型电化学发光生物传感器的制备方法，包括以下步骤：
11、1)将全氟化树脂、乙醇、水和三联吡啶钌混合，制得三联吡啶钌@全氟化树脂溶液；将三联吡啶钌@全氟化树脂溶液滴涂至spe电极表面，制得三联吡啶钌@全氟化树脂/spe传感器；
12、2)将四氯金酸溶液滴涂至步骤1)制得的三联吡啶钌@全氟化树脂/spe传感器表面，并对传感器表面镀金，制得金/三联吡啶钌@全氟化树脂/spe传感器；
13、3)将凝血酶特异性肽段溶液滴涂至金/三联吡啶钌@全氟化树脂/spe传感器表面反应，并用巯基己醇封闭未结合的空白位点，制得肽段/金/三联吡啶钌@全氟化树脂/spe传感器。
14、优选地，步骤1)中，全氟化树脂、乙醇、水和三联吡啶钌的体积比为1:1:1:16。
15、优选地，步骤2)中，采用电沉积法对传感器表面镀金。
16、进一步优选地，电沉积过程中，电沉积电位为-0.6v，镀金时间为5s。
17、优选地，步骤3)中，反应条件为25℃反应6h。
18、本专利技术的第三个方面，公开了上述测定凝血酶活性的微型电化学发光生物传感器在检测凝血酶活性中的应用。
19、优选地，测定凝血酶活性的微型电化学发光生物传感器能够检测血清、血浆和全血中凝血酶活性。
20、本专利技术的第四个方面，公开了一种凝血酶活性检测系统，包括便携式电化学发光检测仪和上述测定凝血酶活性的微型电化学发光生物传感器。
21、本专利技术的第五个方面，公开了一种检测凝血酶活性的方法，将待测血液滴涂至上述测定凝血酶活性的微型电化学发光生物传感器表面反应，根据反应前后凝血酶发光信号变化值，获取凝血酶活性值。
22、进一步地，通过制备不同活性的凝血酶标准溶液，并利用上述测定凝血酶活性的微型电化学发光生物传感器检测反应前后凝血酶发光信号变化值，建立凝血酶活性与凝血酶发光信号变化值的线性回归方程；之后将待测血液的凝血酶发光信号变化值代入凝血酶活性与凝血酶发光信号变化值的线性回归方程中，得到凝血酶活性值。
23、与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：
24、本专利技术提供的一种测定凝血酶活性的微型电化学发光生物传感器，1)采用了spe芯片电极，能够保证微型电化学发光生物传感器的便携性。2)三联吡啶钌固定在spe电极上，可以作为电化学发光信号探针。3)金固定于三联吡啶钌@全氟化树脂/spe电极表面，不仅能增强电子传递速率，还能为凝血酶特异性肽段提供结合位点，准确、直接反映出血液中凝血酶活性的数值。4)对spe电极表面的空白位点均进行了封闭，能够保证检测结果的准确性。5)传感器中连接的凝血酶特异性肽段，能够被凝血酶特异性识别并切割，通过fc的远离影响电化学发光信号的变化，实现活性检测。该微型电化学发光生物传感器与荧光技术相比，不需依赖激发光源就能检测凝血酶活性；与现有的化学发光仪相比，构建过程简单，装置设备为常规仪器体积的1/5，易于便携化，检测结果准确，稳定性好，特异性好，应用场景广泛，如床旁检测、居家检测、户外旅游站点检测，临床诊断与监测、手术与创伤管理、药物疗效监测、指导新型本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种测定凝血酶活性的微型电化学发光生物传感器，其特征在于，包括SPE电极，所述SPE电极上依次固定有三联吡啶钌、金和凝血酶特异性肽段，SPE电极表面的空白位点均被封闭；
2.根据权利要求1所述的一种测定凝血酶活性的微型电化学发光生物传感器，其特征在于，所述凝血酶特异性肽段为Mpr-GGRK(Fc)、Mpr-VPRK(Fc)、Mpr-D(OBZL)PRK(Fc)或Mpr-FPRK(Fc)；
3.根据权利要求1或2所述的一种测定凝血酶活性的微型电化学发光生物传感器，其特征在于，三联吡啶钌通过全氟化树脂膜固定于SPE电极上。
4.根据权利要求1或2所述的一种测定凝血酶活性的微型电化学发光生物传感器，其特征在于，SPE电极表面的空白位点均封闭有巯基己醇。
5.权利要求1～4任意一项所述的测定凝血酶活性的微型电化学发光生物传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤1)中，全氟化树脂、乙醇、水和三联吡啶钌的体积比为1:1:1:16。
7.权利要求1～4任意一项所述
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，测定凝血酶活性的微型电化学发光生物传感器能够检测血清、血浆和全血中的凝血酶活性。
9.一种凝血酶活性检测系统，其特征在于，包括便携式电化学发光检测仪和权利要求1～4任意一项所述的测定凝血酶活性的微型电化学发光生物传感器。
10.一种检测凝血酶活性的方法，其特征在于，将待测血液滴涂至权利要求1～4任意一项所述的测定凝血酶活性的微型电化学发光生物传感器表面反应，根据反应前后凝血酶发光信号变化值，获取凝血酶活性值。
...【技术特征摘要】
1.一种测定凝血酶活性的微型电化学发光生物传感器，其特征在于，包括spe电极，所述spe电极上依次固定有三联吡啶钌、金和凝血酶特异性肽段，spe电极表面的空白位点均被封闭；
2.根据权利要求1所述的一种测定凝血酶活性的微型电化学发光生物传感器，其特征在于，所述凝血酶特异性肽段为mpr-ggrk(fc)、mpr-vprk(fc)、mpr-d(obzl)prk(fc)或mpr-fprk(fc)；
3.根据权利要求1或2所述的一种测定凝血酶活性的微型电化学发光生物传感器，其特征在于，三联吡啶钌通过全氟化树脂膜固定于spe电极上。
4.根据权利要求1或2所述的一种测定凝血酶活性的微型电化学发光生物传感器，其特征在于，spe电极表面的空白位点均封闭有巯基己醇。
5.权利要求1～4任意一项所述的测定凝血酶活性的微型电化学发光生物传感...
【专利技术属性】
技术研发人员：侯晓芳，王嗣岑，魏芬，解笑瑜，景王慧，包涛，张景，
申请(专利权)人：西安交通大学，
类型：发明
国别省市：
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