【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因测序领域，具体而言，涉及一种用于检测甲型流感病毒的探针组合、试剂盒及检测方法。
技术介绍
1、流感（influenza），是一种由流感病毒引起的急性呼吸道传染病。流感病毒根据其表面蛋白的不同，分为甲型（a型）、乙型（b型）、丙型（c型）三种类型；其中，甲型和乙型流感病毒是导致季节性流感流行的主要病毒，乙型流感病毒的变异会产生新的主流毒株，但是新毒株与旧毒株之间存在交叉免疫，即针对旧毒株的免疫反应对新毒株依然有效；而甲型流感病毒是变异最为频繁的一个类型，亚型内部还会发生抗原漂移，一般2~3年发生一次，常引起季节性或地方性流行，每隔十几年就会发生一个抗原性大变异，产生一个新的毒株。
2、甲型流感病毒含有8个负链rna基因组片段，三个中等大小的rna片段编码ha、na和np，其中血凝素（hemagglutinin，ha）和神经氨酸酶（neuraminidase，na）是甲型流感病毒的关键表面蛋白。血凝素呈柱状，为三聚体，它基本上以相同的间距覆盖了病毒的全部表面，在病毒感染的过程中，ha与宿主表面蛋白结合，介导病毒膜与宿主细胞核膜的结合，在病毒传染的过程中发挥重要作用；神经氨酸酶由四个亚单位组成的四聚体，并不平均分布在病毒表面，而是聚合成群，以多重方式参与病毒的复制，促进病毒颗粒从感染的宿主细胞释放。根据病毒表面的血凝素和神经氨酸酶的不同，甲型流感病毒被分为不同的亚型。根据ha以及na基因进行血清型划分，其中ha（1-16）包括h1、h2、h3、h4、h5、h6、h7、h8、h9、h10、h11、h12、h
3、目前，在人群中流行的主要是甲型流感病毒（influenza a virus）的一些亚型h1n1和h3n2流感病毒等。目前对于甲型流感病毒的ha以及na基因变异追踪主要有病毒细胞培养、血清学诊断技术、sanger测序以及靶向ngs检测技术。其中病毒细胞培养为一种经典方法，通过从感染的组织细胞中分离病毒进行鉴定，虽然结果可靠，但需要的时间较长，一般细胞培养需要3-4天，而且高禽流感病毒的分离培养需要在生物安全三级实验室(bsl-3)进行，不适合病毒的快速检测。血清学诊断技术包括血凝试验和血凝抑制试验(hi)、琼脂扩散试验(agp)、elisa法、中和试验(nt)和免疫荧光技术(ifa)等，这些方法特异性好，常用于鉴定亚型，但血清学方法通常需要较长时间的培养和处理。sanger测序流程如下：特异性引物对na以及na基因进行扩增，载体构建，sanger测序，该技术流程较为繁琐，需要根据血清型鉴定病毒亚型，再使用特异性引物进行扩增，引物需要针对保守序列设计，经常出现因病毒变异导致无法完成病原基因组扩增的现象。靶向ngs测序分为多重pcr扩增以及液相杂交捕获技术，其中多重pcr扩增需要覆盖所有亚型的引物，针对变异毒株出现漏检或者无法完成全长基因组的扩增的现象；液相杂交捕获技术根据target序列设计特异性探针，通过探针与靶标特异性结合，将靶标抓捕下来进行测序，探针具有一定的容错性，能够追踪病毒变异情况，但是传统液相杂交捕获技术流程较为繁琐，限制其在病原体检测领域的应用。
4、综上，现有技术中的方法难以对甲型流感病毒已知的所有亚型进行快速、准确的鉴定，急需开发一种新的检测方法。
技术实现思路
1、本专利技术的主要目的在于提供一种用于检测甲型流感病毒的探针组合、试剂盒及检测方法，以解决现有技术中难以快速对甲型流感病毒所有已知亚型进行捕获的问题。
2、为了实现上述目的，根据本专利技术的第一个方面，提供了一种用于检测甲型流感病毒的探针组合，上述探针组合包括用于捕获ha基因的探针和用于捕获na基因的探针，探针组合包括如seq id nos：1-198所示的核酸序列的组合。
3、进一步地，探针组合中的探针上均含有生物标记物。
4、进一步地，生物标记物包括生物素。
5、为了实现上述目的，根据本专利技术的第二个方面，提供了一种用于检测甲型流感病毒的试剂盒，该试剂盒包括上述用于检测甲型流感病毒的探针组合。
6、进一步地，试剂盒中还包括如下任意一种或多种：杂交反应液、洗脱缓冲液、链霉亲和素磁珠、核酸纯化磁珠、反转录缓冲液、pcr缓冲液、逆转录酶、dna聚合酶、末端修复酶、末端修复反应缓冲液、含分子标签的接头、文库扩增引物、接头封闭剂、dna封闭剂、杂交增强剂或捕获文库pcr引物。
7、为了实现上述目的，根据本专利技术的第三个方面，提供了一种甲型流感病毒的检测方法，该检测方法包括：a）提取样本中的rna并进行反转录，获得cdna文库；b）将探针组合与cdna文库进行混合杂交，获得探针-目标片段复合物；探针组合为上述用于检测甲型流感病毒的探针组合、或上述用于检测甲型流感病毒的试剂盒中的探针组合；c）对探针-目标片段复合物进行pcr扩增，获得捕获文库；d）对捕获文库进行测序，实现对样本中的甲型流感病毒的检测。
8、进一步地，甲型流感病毒由ha亚型和na亚型组成，ha亚型选自h1、h2、h3、h4、h5、h6、h7、h8、h9、h10、h11、h12、h13、h14、h15或h16中的任意一种或多种；na亚型选自n1、n2、n3、n4、n5、n6、n7、n8或n9中的任意一种或多种。
9、进一步地，甲型流感病毒包括h1n1、h3n2、h3n8、h5n1、h9n2或h7n9中的任意一种或多种。
10、进一步地，检测方法为非诊断或治疗目的的检测方法。
11、进一步地，b）包括：将cdna文库与探针组合混合，获得杂交体系；将杂交体系置于55-65℃进行杂交0.5-2小时；杂交反应结束后，利用磁珠对杂交体系中的探针-目标片段复合物进行捕获和纯化，获得探针-目标片段复合物。
12、应用本专利技术的技术方案，利用上述探针组合，能够实现对于所有甲型流感病毒亚型的特异性捕获，进而实现在单个样本中实现对甲型流感病毒的分型鉴定，检测速度快，能够满足流行病学病原体检测时效性。
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1.一种用于检测甲型流感病毒的探针组合，其特征在于，所述探针组合包括用于捕获HA基因的探针和用于捕获NA基因的探针，
2.根据权利要求1所述的探针组合，其特征在于，所述探针组合中的探针上均含有生物标记物。
3.根据权利要求2所述的探针组合，其特征在于，所述生物标记物包括生物素。
4.一种用于检测甲型流感病毒的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1-3中任一项所述的用于检测甲型流感病毒的探针组合。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括如下任意一种或多种：杂交反应液、洗脱缓冲液、链霉亲和素磁珠、核酸纯化磁珠、反转录缓冲液、PCR缓冲液、逆转录酶、DNA聚合酶、末端修复酶、末端修复反应缓冲液、含分子标签的接头、文库扩增引物、接头封闭剂、DNA封闭剂、杂交增强剂或捕获文库PCR引物。
6.一种甲型流感病毒的检测方法，其特征在于，所述检测方法包括：
7.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于，所述甲型流感病毒由HA亚型和NA亚型组成，
8.根据权利要求7所述的检测方法，其特
9.根据权利要求6-8中任一项所述的检测方法，其特征在于，所述b）包括：
...【技术特征摘要】
1.一种用于检测甲型流感病毒的探针组合，其特征在于，所述探针组合包括用于捕获ha基因的探针和用于捕获na基因的探针，
2.根据权利要求1所述的探针组合，其特征在于，所述探针组合中的探针上均含有生物标记物。
3.根据权利要求2所述的探针组合，其特征在于，所述生物标记物包括生物素。
4.一种用于检测甲型流感病毒的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1-3中任一项所述的用于检测甲型流感病毒的探针组合。
5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括如下任意一种或多种：杂交反应液、洗脱缓冲液、链霉亲和素磁珠、核酸纯化磁珠、反转...
【专利技术属性】
技术研发人员：崔仑标，葛以跃，吴涛，朱小娟，赵康辰，乔乔，余丽萍，户银芝，
申请(专利权)人：江苏省疾病预防控制中心江苏省预防医学科学院，
类型：发明
国别省市：
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