一种化学-生物级联合成L-草铵膦的方法及突变体技术

本发明专利技术公开了一种化学‑生物级联合成L‑草铵膦的方法及突变体，以甲基亚磷酸二乙酯和丙烯酸加成反应合成3‑(甲基乙氧基膦酰基)丙酸乙酯，然后将3‑(甲基乙氧基膦酰基)丙酸乙酯与乙醇钠缩合反应后，再与草酸二乙酯水解合成2‑羰基‑4‑(羟基甲基膦酰基)丁酸，最后采用草铵膦脱氢酶与醇脱氢酶共表达湿菌体或草铵膦脱氢酶突变体与醇脱氢酶共表达湿菌体为生物催化剂合成L‑草铵膦，解决了现有L‑草铵膦合成繁锁，不对称胺化还原活性不高和稳定性较差的问题。本发明专利技术工艺路线绿色、简单、温和，避免了合成D,L‑草铵膦所用剧毒氰化物，三废产生量较D,L‑草铵膦减少50％以上。本发明专利技术生物催化步骤转化率达到100％，无底物残留，产物ee值大于99％。

【技术实现步骤摘要】

(一)本专利技术属于生物工程和化学化工，具体涉及生物催化剂、突变体和化学-生物级联合成l-草铵膦的新工艺。

技术介绍

0、(二)
技术介绍

1、草铵膦，也称草丁膦，英文名为phsophinothricin(简称ppt)，化学名为2-氨基-4-[羟基(甲基)膦酰基]-丁酸，具有除草活性高、除草谱广及环境相容性好的特点，非常适合发展除草剂抗性基因。草铵膦抗性基因已经导入水稻、小麦、玉米、甜菜、烟草、大豆、棉花、马铃薯、番茄、油菜、甘蔗等20多种作物中，近年来已在美洲、亚洲、欧洲、澳洲等地区的农业大国推广种植这些转基因作物，应用前景非常广阔。但目前，市场上销售的草铵膦一般都是外消旋混合物。其中含有50％d-草铵膦无除草活性，只有l-构型具有植物毒性，且在土壤中易分解，对人类和动物的毒性小，对环境的破坏力小。如果草铵膦产品能以l-构型的光学纯异构体形式使用，可使草铵膦的使用量降低50％，这对于提高原子经济性、降低成本、减轻环境压力都具有十分重要的意义。

2、生成l-草铵膦的方法有化学合成法、发酵法、生物合成法。其中，生物合成法中涉及到的酶类主本文档来自技高网...

【技术保护点】

1.一种合成L-草铵膦的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

2.如权利要求1所述合成L-草铵膦的方法，其特征在于，所述2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸按如下步骤制备：(1)以甲基亚磷酸二乙酯和丙烯酸为原料，在温度100-150℃、压力0.5-5MPa条件下加成反应合成3-(甲基乙氧基膦酰基)丙酸乙酯；

3.如权利要求2所述合成L-草铵膦的方法，其特征在于，步骤(1)所述丙烯酸与甲基亚磷酸二乙酯体积比为1-5:1。

4.如权利要求2所述合成L-草铵膦的方法，其特征在于，步骤(2)缩合反应条件为：温度60℃、压力1.5MPa条件下反应8h；水解反...

【技术特征摘要】

1.一种合成l-草铵膦的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

2.如权利要求1所述合成l-草铵膦的方法，其特征在于，所述2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸按如下步骤制备：(1)以甲基亚磷酸二乙酯和丙烯酸为原料，在温度100-150℃、压力0.5-5mpa条件下加成反应合成3-(甲基乙氧基膦酰基)丙酸乙酯；

3.如权利要求2所述合成l-草铵膦的方法，其特征在于，步骤(1)所述丙烯酸与甲基亚磷酸二乙酯体积比为1-5:1。

4.如权利要求2所述合成l-草铵膦的方法，其特征在于，步骤(2)缩合反应条件为：温度60℃、压力1.5mpa条件下反应8h；水解反应温度为60℃。

5.如权利要求2所述合成l-草铵膦的方法，其特征在于，步骤(2)3-(甲基乙氧基膦酰基)丙酸乙酯体积用量以乙醇钠质量计为20-50l/kg；乙醇钠与草酸二乙酯质量比为1:1-3。

6.如权利要求1所述合成l-草铵膦的方法，其特征在于，反应体系中，湿菌体加入终浓度为10-40g/l，底物加入终浓度为200-800mm；异丙醇加入终浓度为200-1000mm；nad+加入终浓度为0.4-0.8mm。

7.如权利要求1所述合成l-草铵膦的方法，其特征在于，草铵膦脱氢酶突变体是将seqid no.2所示氨基酸序列突变为下列之一：(1)第73位缬氨...

【专利技术属性】
技术研发人员：薛亚平，程峰，邹树平，徐建妙，郑裕国，
申请(专利权)人：浙江工业大学，
类型：发明
国别省市：