【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因工程，涉及一种可控生产单双鼠李糖脂的工程菌及其构建方法和应用。
技术介绍
1、鼠李糖脂是一种具有广泛生物活性的生物表面活性剂，在石油开采、环境修复、化妆品、医药等领域具有巨大的应用潜力。目前，鼠李糖脂的生产主要通过微生物发酵法实现，但产量和纯度受到多种因素的影响，已较难满足日益增长的需求。因此，开发一种高效、稳定的鼠李糖脂生产菌株具有重要意义。
2、鼠李糖脂是由1-2个呈亲水性的鼠李糖分子与1-2个呈疏水性的饱和或不饱和脂肪酸长链(c8−c16)通过β-糖苷键相连接的化学结构多样的同系物。在假单胞菌中，鼠李糖基转移酶i (rhamnosyltransferase i，rhlb)催化r-3-羟基脂肪酸(r-3-hydroxyfattyacids，haas)与dtdp-l-鼠李糖反应合成单鼠李糖脂(mono-rls)，单鼠李糖脂在鼠李糖基转移酶ⅱ (rhamnosyltransferase ⅱ, rhlc)的作用下与另一分子的dtdp-l-鼠李糖缩合成为双鼠李糖脂(di-rls)。通过控制特定酶能够实现合成单一鼠李糖脂，如有研究报道根据铜绿假单胞菌的rhlc基因序列设计pcr引物，pcr产物纯化后克隆到pmd系列t simple载体中构建pmd-rhlc，酶切rhlc基因序列内部，构建目标基因内部序列缺失的质粒pmd-∆rhlc，通过双酶切将∆rhlc片段插入到质粒pk18mobsacb中构建打靶质粒pk18-∆rhlc，导入铜绿假单胞菌内，经筛选压力作用发生二次同源重组，获得敲除rhlc基因的铜绿假单
3、不同的假单胞菌能够产生不同比例的单、双鼠李糖脂混合物，并且其物理化学特性受同系物比例的影响，从而影响其应用效果，因此，开发能够高效生产鼠李糖脂的工程菌，且能控制单、双鼠李糖脂比例，对于鼠李糖脂研究及应用具有重要意义。
技术实现思路
1、针对现有技术的不足和实际需求，本专利技术提供一种可控生产单双鼠李糖脂的工程菌及其构建方法和应用。
2、本专利技术采用以下技术方案：
3、第一方面，本专利技术提供一种可控生产单双鼠李糖脂的工程菌，所述工程菌包括缺失rhlc基因的假单胞菌，所述工程菌还含有重组表达载体，或基因组中整合有重组片段；所述重组表达载体和重组片段各自独立地含有rhlc基因，rhlc基因的启动子为诱导型启动子。
4、可以理解，本专利技术基于假单胞菌设计遗传改造策略，理论上具有rhlc基因的假单胞菌均适用于本专利技术。
5、优选地，所述假单胞菌包括荧光假单胞菌（pseudomonas fluorescens）、铜绿假单胞菌（pseudomonas aeruginosa）或恶臭假单胞菌（pseudomonas putica）中任意一种。
6、优选地，铜绿假单胞菌可购自中国工业微生物菌种保藏管理中心，编号：cicc10351，荧光假单胞菌可购自中国工业微生物菌种保藏管理中心，编号：cicc 23246，恶臭假单胞菌可购自中国工业微生物菌种保藏管理中心，编号：cicc 21906。
7、优选地，所述诱导型启动子包括阿拉伯糖诱导型启动子。
8、优选地，所述重组表达载体的出发载体包括pherd20t载体、prk2013载体或pk18gm载体等中任意一种。
9、第二方面，本专利技术提供一种所述可控生产单双鼠李糖脂的工程菌的构建方法，所述构建方法包括：
10、取假单胞菌，敲除其rhlc基因，并向其中导入重组表达载体，或，在其基因组中整合重组片段；所述重组表达载体和重组片段各自独立地含有rhlc基因，rhlc基因的启动子为诱导型启动子。
11、可以理解，本领域通用的基因敲除和重组表达载体构建方法均适用于本专利技术，只要能实现本专利技术遗传改造策略即可。
12、优选地，所述敲除的方法具体包括：
13、以假单胞菌的基因组为模板，扩增rhlc基因的上、下游片段，回收纯化后分别用bamh i/xho i和xho i/hind ⅲ进行双酶切，回收纯化后与用bamh i/hind ⅲ双酶切回收的pk18gm载体进行连接，得到自杀性质粒pkrhlcgm，利用假单胞菌、助质粒prk2013和所述自杀性质粒pkrhlcgm进行三亲结合。
14、优选地，所述重组表达载体的构建方法具体包括：
15、以假单胞菌的基因组为模板，扩增rhlc基因，回收纯化后与pherd20t质粒分别用ecor i/hind ⅲ进行双酶切，进行连接，得到重组表达载体。
16、第三方面，本专利技术提供所述的可控生产单双鼠李糖脂的工程菌在生产鼠李糖脂中的应用。
17、第四方面，本专利技术提供一种生产鼠李糖脂的方法，所述方法包括：
18、发酵培养所述的可控生产单双鼠李糖脂的工程菌，进行产物纯化，得到鼠李糖脂。
19、可以理解，本领域通用的鼠李糖脂的纯化方法均适用本专利技术。
20、优选地，所述发酵培养的培养基按质量百分比为100%计含有甘油2%~7%、酵母粉1%~3%、蛋白胨1.0%~4%、nano3 0.2%~1%、kh2po4 0.1%~0.8%、na2hpo4·12h2o 0.2%~1.0%、mgso4·7h2o 0.2%~2%、cacl2·2h2o 0.5%~1.5%、feso4 0.5%~0.8%、cocl2 0.2%~1.4%，余量为水。
21、优选地，所述发酵培养的温度为25~38℃（例如可以是26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36或37℃等），ph为6.2~7.2（例如可以是6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7或7.1等）。
22、优选地，所述发酵培养还包括诱导的步骤，具体包括在发酵培养8~12 h（例如可以是8.5、9、9.5、10、10.5、11或11.5 h等），添加0.1 wt %~0.25 wt %阿拉伯糖（例如可以是0.12 wt %、0.15 wt %、0.18 wt %、0.2 wt %、0.22 wt %或0.24%等）进行诱导。
23、本专利技术中，对发酵培养过程进行优化设计，能够进一步提高鼠李糖脂的产量和纯度。
24、与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：
25、本专利技术设计全新的遗传改造策略，鼠李糖脂生产菌株缺失rhlc基因，同时设计回补策略，构建的工程菌能生产不同比例单、双鼠李糖脂，鼠李糖脂的产量也优于野生型宿主菌，此外通过对发酵培养过程进行优化设计，能够进一步提高鼠李糖脂的产量和纯度，方法操作简便、效率高，不需要使用抗生素，可广泛应用于鼠李糖脂的生产中，还可探索最佳的单双鼠李糖脂比例，以便突出鼠李糖脂的某一种特性，使其能更有效地应用于不同领域，也能更好地反映单、双鼠李糖脂对表面性能的影响，排除菌株的影响，同时也简化了生产步骤，从而在实际使用过程中具有可选择性，有利于推动鼠本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种可控生产单双鼠李糖脂的工程菌，其特征在于，所述工程菌包括缺失rhlC基因的假单胞菌，所述工程菌还含有重组表达载体，或基因组中整合有重组片段；
2.根据权利要求1所述的可控生产单双鼠李糖脂的工程菌，其特征在于，所述假单胞菌包括荧光假单胞菌、铜绿假单胞菌或恶臭假单胞菌中任意一种。
3.根据权利要求1所述的可控生产单双鼠李糖脂的工程菌，其特征在于，所述诱导型启动子包括阿拉伯糖诱导型启动子。
4.根据权利要求1所述的可控生产单双鼠李糖脂的工程菌，其特征在于，所述重组表达载体的出发载体包括pHERD20T载体、pRK2013载体或pK18Gm载体中任意一种。
5.一种权利要求1所述的可控生产单双鼠李糖脂的工程菌的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括：
6.根据权利要求5所述的可控生产单双鼠李糖脂的工程菌的构建方法，其特征在于，所述敲除的方法具体包括：
7.根据权利要求5所述的可控生产单双鼠李糖脂的工程菌的构建方法，其特征在于，所述重组表达载体的构建方法具体包括：
8.权利要求1所述的可控生产单双鼠
9.一种生产鼠李糖脂的方法，其特征在于，所述方法包括：
10.根据权利要求9所述的生产鼠李糖脂的方法，其特征在于，所述发酵培养的培养基按质量百分比为100%计含有甘油2%~7%、酵母粉1%~3%、蛋白胨1.0%~4%、NaNO3 0.2%~1%、KH2PO4 0.1%~0.8%、Na2HPO4·12H2O 0.2%~1.0%、MgSO4·7H2O 0.2%~2%、CaCl2·2H2O 0.5%~1.5%、FeSO4 0.5%~0.8%、CoCl2 0.2%~1.4%，余量为水；
...【技术特征摘要】
1.一种可控生产单双鼠李糖脂的工程菌，其特征在于，所述工程菌包括缺失rhlc基因的假单胞菌，所述工程菌还含有重组表达载体，或基因组中整合有重组片段；
2.根据权利要求1所述的可控生产单双鼠李糖脂的工程菌，其特征在于，所述假单胞菌包括荧光假单胞菌、铜绿假单胞菌或恶臭假单胞菌中任意一种。
3.根据权利要求1所述的可控生产单双鼠李糖脂的工程菌，其特征在于，所述诱导型启动子包括阿拉伯糖诱导型启动子。
4.根据权利要求1所述的可控生产单双鼠李糖脂的工程菌，其特征在于，所述重组表达载体的出发载体包括pherd20t载体、prk2013载体或pk18gm载体中任意一种。
5.一种权利要求1所述的可控生产单双鼠李糖脂的工程菌的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括：
6.根据权利要求5所述的可控生产单双鼠李糖脂的工程...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘开开，杨付伟，姜西娟，石森，张雅萍，刘振兴，
申请(专利权)人：万华化学集团股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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