【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物，具体涉及一种检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的pcr引物组和基于单分子测序的纳米孔测序方法。
技术介绍
1、prrs(猪繁殖与呼吸综合征，又称猪蓝耳病)，是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus，prrsv)引起的重要传染病，引起妊娠母猪繁殖障碍和各年龄阶段猪的呼吸道症状。妊娠母猪发病后，产仔率下降、流产、死胎及弱胎率可达30％～100％；育肥猪发病后，表现为呼吸困难、多继发感染、生产缓慢和饲料报酬降低等。
2、prrsv是单股正链rna病毒，分为欧洲型(基因i型)毒株和美洲型(基因ii型)毒株。prrsv具有超强的变异能力，形成了多种变异毒株循环流行的复杂局面。高致病性prrsv(hp-prrsv)特征是病毒nsp2蛋白上出现30个氨基酸不连续缺失，至今依然是主要流行毒株之一。2012年发现了与nadc30毒株高度同源的nadc30样毒株(nadc30-like prrsv)，其特征为nsp2不连续缺失131个氨基酸，2017年又发现了nadc34样prrsv(nadc34-like prrsv)，其nsp2蛋白出现100个氨基酸连续缺失，对仔猪的致病性相对较低，是一种潜在流行毒株。
3、prrs自发现至今已有30余年，科研人员在该病的病原分离鉴定、病毒遗传变异、病毒蛋白结构与功能、免疫与致病机制、疫苗与诊断制剂创制以及防控技术等方面取得了一些重要的研究进展，促进了对该病的认识。
4、尽管
技术实现思路
1、本部分的目的在于概述本专利技术的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。
2、作为本专利技术其中一个方面，本专利技术提供一种检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的pcr引物组，其中：所述pcr引物组由12对引物及其探针组成，所述pcr引物的序列如seq id no：1～36所示。
3、本专利技术还提供所述的基于单分子测序的纳米孔测序方法：包括采用权利要求1所述的pcr引物组检测猪繁殖与呼吸综合征病毒六种类型，包括prrsv-1(欧洲型，以lelystadvirus，即lv株为代表)、美洲型中的c-prrsv(经典毒株，以vr-2332毒株为代表)、hp-prrsv(高致病性prrsv毒株，以jxa1毒株为代表)、nadc30毒株、nadc34毒株、gm2毒株。
4、作为本专利技术所述的单分子测序的纳米孔测序方法的一种优选方案：包括以下步骤，
5、(1)样本的采集及病毒核酸提取；
6、(2)12重荧光定量pcr的扩增；
7、(3)构建测序文库；
8、(4)蓝耳多基因型测序；
9、(5)生物信息学分析；
10、其中，所述12重荧光定量pcr的扩增采用权利要求1所述的12对引物及其探针进行pcr扩增。
11、作为本专利技术所述的单分子测序的纳米孔测序方法的一种优选方案：所述12重荧光定量pcr的扩增程序为：预变性95℃3min，变性95℃10s，延伸65℃3min，反应循环数40。
12、作为本专利技术所述的单分子测序的纳米孔测序方法的一种优选方案：所述样本包括唾液样本、环境样本、血液样本、组织样本。
13、作为本专利技术所述的单分子测序的纳米孔测序方法的一种优选方案：所述构建测序文库是按照连接试剂盒构建纳米孔测序文库，包括pcr产物纯化、末端修复、标签连接、接头连接。
14、作为本专利技术所述的单分子测序的纳米孔测序方法的一种优选方案：所述生物信息学分析包括数据库建立、数据抓取、去宿主序列、数据分析、检测病原占比统计、数据库比对。
15、本专利技术的有益效果：本专利技术多重pcr扩增特异性引物组可实现快速鉴别蓝耳的六种基因分型：prrsv-1欧洲毒株、代表谱系5的prrsv美洲经典毒株(c-prrsv)、代表谱系8的高致病毒株(hp-prrsv)、代表谱系1的nadc30毒株(nadc30)和nadc34毒株(nadc34)、代表谱系3的gm2毒株。每种基因分型设计了两对引物。本专利技术能够在一个反应孔中同时检测每个样本中的蓝耳基因型，本专利技术方法对大规模养殖的常态蓝耳检测以及蓝耳疫情发生时的紧急防控有重大意义。
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1.一种检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的PCR引物组，其特征在于：所述PCR引物组由12对引物及其探针组成，所述PCR引物的序列如SEQ ID NO：1～36所示。
2.一种基于单分子测序的纳米孔测序方法，其特征在于：包括采用权利要求1所述的PCR引物组检测猪繁殖与呼吸综合征病毒六种类型，分别为PRRSV欧洲型毒株、美洲型毒株中的C-PRRSV毒株、高致病性HP-PRRSV毒株、NADC30毒株、NADC34毒株、PRRSVGM2毒株。
3.根据权利要求2所述的单分子测序的纳米孔测序方法，其特征在于：包括以下步骤，(1)样本的采集及病毒核酸提取；
4.根据权利要求3所述的单分子测序的纳米孔测序方法，其特征在于：所述12重荧光定量PCR的扩增程序为预变性95℃3min，变性95℃10s，延伸65℃3min，反应循环数40。
5.根据权利要求3或4所述的单分子测序的纳米孔测序方法，其特征在于：所述样本包括唾液样本、环境样本、血液样本、组织样本。
6.根据权利要求3所述的单分子测序的纳米孔测序方法，其特征在于：所述构建测序文库是按
7.根据权利要求3所述的单分子测序的纳米孔测序方法，其特征在于：所述生物信息学分析包括数据库建立、数据抓取、去宿主序列、数据分析、检测病原占比统计、数据库比对。
...【技术特征摘要】
1.一种检测猪繁殖与呼吸综合征病毒的pcr引物组，其特征在于：所述pcr引物组由12对引物及其探针组成，所述pcr引物的序列如seq id no：1～36所示。
2.一种基于单分子测序的纳米孔测序方法，其特征在于：包括采用权利要求1所述的pcr引物组检测猪繁殖与呼吸综合征病毒六种类型，分别为prrsv欧洲型毒株、美洲型毒株中的c-prrsv毒株、高致病性hp-prrsv毒株、nadc30毒株、nadc34毒株、prrsvgm2毒株。
3.根据权利要求2所述的单分子测序的纳米孔测序方法，其特征在于：包括以下步骤，(1)样本的采集及病毒核酸提取；
4.根据权利要求3所述的单分子测序的纳米...
【专利技术属性】
技术研发人员：李龙，邱话龙传，周静，蔡承志，郑佳佳，李沛东，邓侨，徐洋，董恩球，
申请(专利权)人：浙江农林大学，
类型：发明
国别省市：
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