【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物领域，具体涉及一种用于靶向敲除鸡pparγ基因的sgrna及其载体和应用。
技术介绍
1、鸡不仅是一个重要的经济动物，还是发育生物学和免疫学等研究的一个重要动物模型。在现在肉鸡产业中，由于长期的遗传选择，肉鸡的生长速度和产肉量都得到显著提高，但随之而来是肉鸡出现脂肪过度蓄积，特别是腹部脂肪过多蓄积。脂肪过度蓄积会导致鸡的饲料转化效率下降，肉品质降低，养鸡企业经济效益减少，消费者购买欲下降等。因此，了解肉鸡脂肪生成和脂肪生长发育的分子机制，减少腹部脂肪过度沉积，创制低脂肉鸡新品种已成为肉鸡种业发展的目标之一。
2、pparγ基因位于鸡12号染色体上，编码两个蛋白异构体(pparγ1和pparγ2)，是目前已知脂肪生成最重要的一个关键转录因子。体外功能分析发现pparγ在脂肪细胞分化中发挥关键调控作用，在成纤维细胞或肌细胞中过表达pparγ能促进这两种细胞向脂肪细胞转分化。在3t3-l1脂肪细胞中，沉默pparγ会导致脂肪细胞去分化和脂质减少以及成熟脂肪细胞标志基因的表达下降。体内研究表明，完全敲除pparγ后会导致鼠胎盘功能障碍和胚胎致死。为了研究pparγ在脂肪生成中的作用，人们构建了脂肪特异性pparγ敲除小鼠。脂肪组织特异性pparγ敲除鼠仍可形成脂肪组织，但小鼠白色脂肪和棕色脂肪降低，脂肪细胞标志基因表达减少，脂肪和肝脏中脂肪垫大小减少并产生胰岛素抵抗。我们前期研究发现鸡pparγ基因在脂肪生成中也发挥重要作用，过表达pparγ能够抑制鸡前脂肪细胞的增殖，促进前脂肪细胞分化；敲除pparγ基因
3、目前，随着基因功能和调控研究的深入，人们已经意识到简单的基因敲除无法精确解析基因功能、基因互作以及基因的调控网络，而是需要建立组织和细胞特异性基因敲除、可诱导性敲除，以及基因特异标记(示踪)、精准碱基替换或删除等技术。crispr/cas9系统已广泛应用于indel以及基因敲入等突变体的制备。crispr/cas9主要有两种敲入方法，分别是非同源末端连接(non-homologous end joining，nhej)和同源重组(homology-directed repair，hdr)方法。hdr修复途径主要发生在细胞周期的s期和g2期，nhej修复发生在细胞周期所有阶段，因此，nhej方法整合效率明显高于hdr。hiti(homology-independent targeted integration)方法是一种nhej介导的整合方法，整合效率高，通过在供体载体两端加入与靶向位点反向的向导sgrna切割位点以此实现体内线性化，同时也大大降低反向整合事件，这种方法广泛应用于哺乳动物的基因敲除。目前靶向敲除鸡pparγ基因的grna设计在第四外显子，这种方法并没有影响pparγ基因的转录和翻译起始，只是导致该基因内部发生移码突变，导致pparγ基因最终只能表达其n端部分(1-186aa)。另一种是pparγ基因的大片段敲除方法，该方法效率低，且基因组大片段敲除会导致一些重要的基因组顺式调控元件丢失，这会改变其他基因的表达调控和基因组稳定性等。在这两种鸡pparγ基因敲除方法中，敲除细胞的筛选都非常繁琐，需要采用pcr扩增靶序列片段以及克隆测序才能鉴定出敲除细胞，费时费力。
技术实现思路
1、基于以上不足之处，本专利技术提供一种用于靶向敲除鸡pparγ基因的sgrna及其载体和应用。
2、为实现上述目的，本专利技术具体是通过如下技术方案实现的：一种用于靶向敲除鸡pparγ基因的sgrna，所述的sgrna核苷酸序列如seq id no.1所示。
3、进一步的，本专利技术还提供一种重组载体，所述的重组载体包含如上所述的sgrna。
4、进一步的，所述的重组载体为cas9/grna载体。
5、进一步的，本专利技术还提供如上所述的sgrna或所述的重组载体在靶向敲除鸡pparγ基因中的应用。
6、本专利技术的另一目的是提供一种含有红色荧光蛋白标记的鸡pparγ基因突变细胞株的构建方法，本方法利用crispr/cas9系统靶向敲入红色荧光蛋白mcherry的同时使pparγ基因敲除，进而可通过观察细胞是否表达红色荧光来检测细胞是否编辑成功，为后续pparγ基因编辑细胞的检测，节省了时间和费用，构建方法步骤如下：
7、s1、根据靶向敲除鸡pparγ基因的sgrna序列，设计一条反向互补核苷酸链并将二者混合退火形成双链，所述的sgrna核苷酸序列如seq id no.1所示；
8、s2、将所述的双链与家禽cas9/grna载体连接，得到重组载体；
9、s3、以mcherry-puro质粒为模板，利用引物组hiti-f/r进行pcr扩增，所述的引物组hiti-f/r的核苷酸序列分别如seq id no.2和seq id no.3所示，将pcr扩增产物进行胶回收纯化后与peasy-blunt载体连接，得到供体载体；
10、s4、将所述的重组载体和供体载体共转染鸡源细胞，经培养、筛选、鉴定，得到含有红色荧光标记的鸡pparγ基因敲除的细胞株。
11、进一步的，如上所述的步骤s4中通过红色荧光进行流式细胞仪筛选。
12、进一步的，本专利技术还提供通过如上所述的构建方法得到的一种含有红色荧光标记的鸡pparγ基因敲除的细胞株。
13、进一步的，本专利技术还提供如上所述的一种细胞株在制备基因编辑鸡时对pparγ基因敲除细胞进行特异性标记或示踪的应用。
14、本专利技术的优点及有益效果：本专利技术的grna设计在第二外显子，由于基因组中插入了报告基因，因此既可以使pparγ敲除，也不易导致产生其它新蛋白，基因编辑效率为75.4％，并且本专利技术利用crispr/cas9系统靶向敲入mcherry(红色荧光蛋白)的同时使pparγ基因敲除，从而可通过观察细胞是否表达红色荧光来检测细胞是否编辑成功，实现对基因或细胞的特异标记；本专利技术具有节省时间和费用的优点，为深入研究pparγ基因在鸡脂肪生成和脂肪生长发育中的作用和机制奠定基础，有利于进一步解析肉鸡腹脂沉积的遗传机制和优质低脂肉鸡的分子育种。
本文档来自技高网...【技术保护点】
1.一种用于靶向敲除鸡PPARγ基因的sgRNA，其特征在于，所述的sgRNA核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
2.一种重组载体，其特征在于，所述的载体包含如权利要求1所述的sgRNA。
3.根据权利要求2所述的重组载体，其特征在于，所述的重组载体为cas9/gRNA载体。
4.根据权利要求1所述的sgRNA或权利要求2或3所述的重组载体在靶向敲除鸡PPARγ基因中的应用。
5.一种含有红色荧光标记的鸡PPARγ基因突变细胞株的构建方法，其特征在于，步骤如下：
6.根据权利要求5所述的一种含有红色荧光标记的鸡PPARγ基因突变细胞株的构建方法，其特征在于，步骤S4中通过红色荧光进行流式细胞仪筛选。
7.根据权利要求5或6所述的构建方法得到的一种含有红色荧光标记的鸡PPARγ基因沉默的细胞株。
8.根据权利要求7所述的一种细胞株在制备基因编辑鸡时对PPARγ基因敲除细胞进行特异性标记或示踪的应用。
【技术特征摘要】
1.一种用于靶向敲除鸡pparγ基因的sgrna，其特征在于，所述的sgrna核苷酸序列如seq id no.1所示。
2.一种重组载体，其特征在于，所述的载体包含如权利要求1所述的sgrna。
3.根据权利要求2所述的重组载体，其特征在于，所述的重组载体为cas9/grna载体。
4.根据权利要求1所述的sgrna或权利要求2或3所述的重组载体在靶向敲除鸡pparγ基因中的应用。
5.一种含有红色...
【专利技术属性】
技术研发人员：景洋，牟芳，邢晓旭，王宁，李辉，徐海冬，
申请(专利权)人：东北农业大学，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。