一种体外检测精子存活率的方法技术

本发明专利技术公开了一种体外检测精子存活率的方法，其特征在于，所述的方法包括步骤：（ａ）将精子悬浮液和膜通透性的核染料混合得到待测样品１；所述的膜通透性的核染料选自Ｔｒａｎｓｇｒｅｅｎ、ＳＹＴＯ或ＳＹＢＲ；（ｂ）用荧光酶标仪检测待测样品１，得到第１次样品检测荧光强度；（ｃ）将待测样品１和碘化丙啶（ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ？ｉｏｄｉｄｅ，ＰＩ）混合得到待测样品２；（ｄ）用荧光酶标仪检测待测样品２，得到第２次样品检测荧光强度；和（ｅ）得到存活系数越大，精子存活率越大。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物检测领域，尤其涉及一种体外检测精子存活量的方法，换言之是一种检测精子质膜损伤情况的新方法。
技术介绍
目前，评价精子质膜完整性的主要方法有常规染色法、低渗膨胀试验 (hypoosmotic swelling test, HOST)和荧光分子探针染色法。常规染色法至今还是国内 临床男科实验室的常用方法，主要有伊红染色、伊红-苯胺黑(eosin-nigrosin stain)、台 盼蓝(typan blue stain)染色以及伊红_苯胺黑_吉姆萨染色法等。这些方法操作要复 杂，而且高估了死精子的比例，更重要的是不同的实验室之间，检测结果差异较大。 低渗膨胀试验由Jeyendran等于1984年报道，当精子处于低渗溶液中时，质膜外 的水分子进入精子以达到细胞内外的渗透压平衡，这时精子尾部发生膨胀弯曲，说明精子 质膜是完整的。这种方法廉价简单，但是准确性低，主观性强，只能用于粗略评价精子质膜 完整性。 近年来利用能区分死活精子及非细胞成分的荧光探针染色方法，不仅具有简便、 快速且准确的特点，而且一些荧光探针在一定时间内对细胞没有损伤作用，对精子的活率 没有明显影响，在同一个视野中，既能观察精子的活率，又能获得存活率的结果，因此结果更一致。 目前市售的精子存活率荧光染色试剂盒只有Invitrogen公司推出的LIVE/DEAD Sperm Viability Kit,该试剂盒主要包括两个荧光探针SYBR-14和碘化丙锭(propidium iodide,PI) 。 PI是常规的死细胞特异性荧光探针，而SYBR-14具有膜通透性，因此死、活精 子均着色。在荧光显微镜下，着绿色荧光的是活精子，红色荧光的是死精子。计算得到的精 子存活率(viability)就反映了质膜完整的精子所占的比例。由于该试剂盒价格昂贵，因 此荧光染色法没有在国内临床男科实验室普及。 通过荧光显微镜下人工计数红、绿精子比例的方法评价质膜完整性，受到主观因 素的影响，且受视野所限，只能检测每份样品中极少量精子，死精子凝集等情况能造成死活 精子分布不均匀，严重影响结果的可靠程度。有条件的实验室使用流式细胞仪可以较为可 靠地进行检测，但是流式细胞仪价格昂贵难以普及，仅限于少数实验室使用，无法成为医院 里的常规检查项目；且操作复杂技术要求较高，实际应用的效率较低。 因此本领域迫切需要提供一种简便、价廉、而有效的体外检测精子存活量，即评价 精子质膜完整性的方法。
技术实现思路
本专利技术旨在提供一种体外检测精子存活量的方法。 在本专利技术中，提供了，所述的方法包括步骤 (a)将精子悬浮液和膜通透性的核染料混合得到待测样品1 ;所述的膜通透性的3核染料选自Transgreen、 SYT0或SYBR ; (b)用荧光酶标仪检测待测样品l，得到第1次样品检测荧光强度； (c)将待测样品1和碘化丙啶(propidium iodide, PI)混合得到待测样品2 ; (d)用荧光酶标仪检测待测样品2，得到第2次样品检测荧光强度；和f 、但别方并玄粉—第2次样品检测荧光强度亡、工-1站+姓^亡、工曰站+ (e)得至瞎^系^—第欣样品检测焚光强度布舌系数越大，精子存活直越大。在另一优选例中，所述的方法包括步骤 (a)将精子悬浮液和精子培养液分别同膜通透性的核染料混合得到待测样品1和 对照样品1 ;所述的膜通透性的核染料选自Transgreen、 SYT0或SYBR ;所述的精子培养液 选自HTF (Human Tubal Fluid人输卵管液)、B丽培养液、或M16培养液； (b)用荧光酶标仪分别检测待测样品1和对照样品l，得到第1次样品检测荧光强 度和第1次对照检测荧光强度； (c)将待测样品1和对照样品1分别同碘化丙啶(propidium iodide,PI)混合得 到待测样品2和对照样品2 ; (d)用荧光酶标仪分另U检领U待领U样品2禾P对照样品2，得到第2次样品检测荧光强度和第2次对照检测荧光强度；和f 、阔左莊玄粉第2次样品检测荧光强度一第2次对照检测荧光强度+ (e)勿到存^《^二第欣样品检测荧光强度-節次对照检测荧光强度'&舌《数越大，精子存活量越大。 在另一优选例中，精子悬浮液和所述的膜通透性的核染料的混合大于等于20分钟后用荧光酶标仪检测待测样品l，得到第1次样品检测荧光强度。 在另一优选例中，所述的精子悬浮液是将精液和精子培养液混合。在另一优选例中，所述的待测样品1 、对照样品1 、待测样品2、和对照样品2都在酶标板上515nm。在另一优选例中，所述的荧光酶标仪检测波长为470nm或516nm。 在另一优选例中，所述的荧光酶标仪检测时，激发光波长为485nm，吸收波长为在另一优选例中，所述的精子悬浮液中的精子来自人、鼠、猪、牛、羊、狐等动物。 据此，本专利技术提供了一种简便、价廉、而有效的体外检测精子存活量，即评价精子质膜完整性的方法c附图说明 图1显示了 Transgreen/PI复染法荧光显微镜下的示意图。 图2显示了 Transgreen进入精子过程中荧光强度变化的曲线。 图3显示了使用Transgreen/PI和荧光酶标仪测定存活系数，两次重复测量值之间的散点图。 图4显示了使用Transgreen/PI在荧光显微镜下计数法测定存活率，两次重复测 量值之间的散点图。 图5显示了同一份精子悬浮液稀释为5种不同密度时的存活系数。 图6显示了存活系数和存活率的相关分析结果。 具体实施例方式专利技术人经过充分的研究和深入地思考，建立了将荧光染料结合荧光酶标仪体外检 测精子存活量的方法，该方法充分利用荧光酶标仪不受主观因素影响而且没有视野所限的 优势；另外由于特定波长下激发的荧光强度的强弱可以标定DNA的量，因此通过荧光染料 与DNA结合，可以间接定量细胞数，通过荧光强度的对比获得一个新的指标，即存活系数。 由于存活系数是一个比值，没有单位，不受绝对荧光强度的影响，因此不论精子数量多少， 荧光强度多高，只要质膜完整的精子比例恒定，存活系数也是一个定值。本专利技术的方法无需 事先处理精子，无需调整密度，可以直接加样测量，十分方便。 具体地，专利技术人发现当精子悬浮液中只有膜通透性的核染料染色时，膜通透性的 核染料的荧光强度间接代表了精子悬浮液中所有细胞的DNA总量；当用膜通透性的核染料 /PI染色时，根据PI只与死细胞DNA结合且与DNA结合能力强于膜通透性的核染料的特点， 膜通透性的核染料只与活细胞的DNA结合，膜通透性的核染料的荧光强度间接代表精子悬 浮液中活细胞DNA的总量，两种染色方法分别测得的荧光强度的比值就可以代表精子悬浮 液中活细胞在所有细胞中的比例，即存活系数，代表活精子(质膜完整的精子)的发光强度 与所有精子发光强度的比值。 更佳地，所述的检测方法将精子悬浮液和精子培养液分别同染料Transgreen混 合得到待测样品1和对照样品1 ;然后用荧光酶标仪分别检测待测样品1和对照样品l，得 到第1次样品检测荧光强度和第1次对照检测荧光强度；再将待测样品1和对照样品1分 别同PI混合得到待测样品2和对照样品2 ;然后用荧光酶标仪分别检测待测样品2和对照 样品2，得到第2次样品检测荧光强度和第2次对照检测荧光本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种体外检测精子存活率的方法，其特征在于，所述的方法包括步骤：（ａ）将精子悬浮液和膜通透性的核染料混合得到待测样品１；所述的膜通透性的核染料选自Ｔｒａｎｓｇｒｅｅｎ、ＳＹＴＯ或ＳＹＢＲ；（ｂ）用荧光酶标仪检测待测样品１，得到第１次样品检测荧光强度；（ｃ）将待测样品１和碘化丙啶（ｐｒｏｐｉｄｉｕｍｉｏｄｉｄｅ，ＰＩ）混合得到待测样品２；（ｄ）用荧光酶标仪检测待测样品２，得到第２次样品检测荧光强度；和（ｅ）得到存活系数＝第２次样品检测荧光强度／第１次样品检测荧光强度，存活系数越大，精子存活量越大。

【技术特征摘要】
一种体外检测精子存活率的方法，其特征在于，所述的方法包括步骤(a)将精子悬浮液和膜通透性的核染料混合得到待测样品1；所述的膜通透性的核染料选自Transgreen、SYTO或SYBR；(b)用荧光酶标仪检测待测样品1，得到第1次样品检测荧光强度；(c)将待测样品1和碘化丙啶(propidium iodide，PI)混合得到待测样品2；(d)用荧光酶标仪检测待测样品2，得到第2次样品检测荧光强度；和(e)存活系数越大，精子存活量越大。F2008102076601C0000011.tif2. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的方法包括步骤(a) 将精子悬浮液和精子培养液分别同膜通透性的核染料混合得到待测样品l和对照 样品1 ;所述的膜通透性的核染料选自Transgreen、SYTO或SYBR;所述的精子培养液选自 HTF (Human Tubal Fluid人输卵管液)、B丽培养液、或M16培养液；(b) 用荧光酶标仪分别检测待测样品1和对照样品l，得到第1次样品检测荧光强度和 第1次对照检测荧光强度；(c) 将待测样品l和对照样品l分别同碘化丙啶(propidium iodide,PI)混合得到待 ...

【专利技术属性】
技术研发人员：施惠娟，赵洪鑫，贾晓峰，袁瑶，史庭燕，刁华，林菊芳，宋丽伟，时伟丽，徐彦，
申请(专利权)人：上海市计划生育科学研究所，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]