一种基于感受态芽孢与根瘤农杆菌共孵育的莱氏绿僵菌遗传转化方法及应用技术

本发明专利技术涉及生物防治技术领域，具体涉及一种基于感受态芽孢与根瘤农杆菌共孵育的莱氏绿僵菌遗传转化方法及应用，本发明专利技术通过根癌农杆菌的转化成功将莱氏绿僵菌菌株SZCY201010中NOR_03501基因敲除。通过感受态芽孢与根瘤农杆菌共孵育，将挑选的转化子的成功转化率提高到54％(NOR_03501)。同时，本发明专利技术对比了分生孢子、芽孢、冻存芽孢、芽生孢子和感受态芽孢的转化率，确定了利用感受态芽孢的遗传转化率是最高的。最后，还利用PCR、激光共聚焦荧光快速筛查、RT‑qPCR技术对真菌的转化子进行验证，验证了本技术的可靠性。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物防治，具体涉及一种基于感受态芽孢与根瘤农杆菌共孵育的莱氏绿僵菌遗传转化方法及应用。

技术介绍

1、莱氏绿僵菌，又名莱氏野村菌，是一种丝状昆虫病原真菌，它能感染很多鳞翅目昆虫，如草地贪夜蛾、棉铃虫、斜纹夜蛾。尤其是在近年来爆发的草地贪夜蛾灾害中，很多莱氏绿僵菌菌株被分离纯化从患病的草地贪夜蛾虫尸上在田间。可见，莱氏绿僵菌对于防治草地贪夜蛾具有良好的研究价值和应用前景。不仅如此，莱氏绿僵菌还是一种植物内生菌，它在植物-内生真菌-昆虫之间的相互作用方面起到重要作用。然而，莱氏绿僵菌作为一种二态型真菌，生长较为缓慢，与其他昆虫病原真菌相比。因此，通过遗传转化手段获取开发并改造莱氏绿僵菌是一项急需解决的问题。

2、自mishra和tatum(1973)首次报道粗糙脉孢菌的dna转化以来，许多丝状真菌已实现了dna转化。诸如球孢白僵菌这些昆虫病原真菌的遗传转化相继得到建立，广泛地应用到基因功能解析以及相关的病理学及生理学研究。dna遗传转化是人们进行菌种改良、有用基因克隆或基因功能研究的重要途径。近年来，真菌遗传转化得到迅猛发展，并应用到本文档来自技高网...

【技术保护点】

1.一种基于感受态芽孢与根瘤农杆菌共孵育的莱氏绿僵菌遗传转化方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.如权利要求1所述的基于感受态芽孢与根瘤农杆菌共孵育的莱氏绿僵菌遗传转化方法，其特征在于：所述步骤S1具体包括：由p-GTB载体改造而来的pGTH被用于敲除工程菌株构建，大肠杆菌菌株DH-5α用于构建和二元载体的扩增；

3.如权利要求1所述的基于感受态芽孢与根瘤农杆菌共孵育的莱氏绿僵菌遗传转化方法，其特征在于：所述步骤S1还包括：pGTH原始载体均使用XmaI和BamHI限制性内切酶双酶切；酶切产物使用PCR产物纯化试剂盒纯化；将回收得到的载体骨架片段与目的基因的上游片...

【技术特征摘要】

1.一种基于感受态芽孢与根瘤农杆菌共孵育的莱氏绿僵菌遗传转化方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.如权利要求1所述的基于感受态芽孢与根瘤农杆菌共孵育的莱氏绿僵菌遗传转化方法，其特征在于：所述步骤s1具体包括：由p-gtb载体改造而来的pgth被用于敲除工程菌株构建，大肠杆菌菌株dh-5α用于构建和二元载体的扩增；

3.如权利要求1所述的基于感受态芽孢与根瘤农杆菌共孵育的莱氏绿僵菌遗传转化方法，其特征在于：所述步骤s1还包括：pgth原始载体均使用xmai和bamhi限制性内切酶双酶切；酶切产物使用pcr产物纯化试剂盒纯化；将回收得到的载体骨架片段与目的基因的上游片段连接；转化至感受态大肠杆菌，筛选连接正确的阳性单菌落；一元载体pgth使用xbai和hpai限制性内切酶双酶切，酶切产物电泳分离，切胶回收载体骨架片段；将回收得到的载体骨架片段与酶切后的下游目的基因表达盒和下游目的基因表达盒连接；转化至感受态大肠杆菌；筛选连接正确的阳性单菌落；得到的目的基因的二元敲除载体。

4.如权利要求1所述的基于感受态芽孢与根瘤农杆菌共孵育的莱氏绿僵菌遗传转化方法，其特征在于：所述步骤s2具体包括：agrobacterium tumefaciensagl-1用于农杆菌质粒转化；将5μl质粒加入到农杆菌感受态细胞中，混匀，转至液氮中放置5min，然后再将感受态细胞放入37℃水浴锅温育5min；取出感受态，加入1ml无抗性yeb液体培养基中，于28℃，220rpm震荡培养2-3h；最后将50-100μl菌液涂布于ye...

【专利技术属性】
技术研发人员：彭跃进，陈斌，王广，张栩，杜广祖，王文倩，
申请(专利权)人：云南农业大学，
类型：发明
国别省市：