人ＭＥＤ１９基因在肿瘤治疗中的新用途制造技术

本发明专利技术属于生物技术领域，具体涉及人ＭＥＤ１９基因在肿瘤治疗中的新用途。现研究表明ＭＥＤ１９在肿瘤发生发展中具有重要的生物学功能，与正常组织相比，ＭＥＤ１９基因在肿瘤组织中广泛高表达。针对人ＭＥＤ１９基因设计的ＲＮＡ干扰慢病毒，特异干扰并下调ＭＥＤ１９基因的表达后，可以抑制肿瘤细胞的生长、侵袭，促进肿瘤细胞的凋亡、抑制肿瘤细胞成瘤。ＭＥＤ１９基因可以作为肿瘤治疗的分子靶标。针对ＭＥＤ１９基因的ｓｉＲＮＡ沉默可作为肿瘤治疗的一种新型工具。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物
，具体涉及人MED19基因在肿瘤治疗中的新用途。
技术介绍
RNA干扰现象是细胞内自主产生的生物进化过程中一项保守的防御机制。SiRNA 被认为是RNA干扰的主要效应物，已成为一种通过抑制目的基因的表达来研究哺乳动物基 因产物功能的强大的工具。直接转染合成的siRNA能特异性抑制哺乳动物细胞内同源基因 的表达，但细胞内siRNA很容易被降解，因此这种方法不能实现稳定的RNA干扰。慢病毒载 体在哺乳动物体内感染效率高、免疫原性低、且能感染分裂相和非分裂相细胞。由于病毒 载体的这些特性，慢病毒介导RNA干扰能在各类哺乳动物细胞长期稳定表达siRNA，抑制基 因表达；具有高效、稳定、特异性强、适用范围广的特点，已成为RNA干扰技术的主要研究工 具。RNA干扰技术在生物医药研究上的应用为临床肿瘤的应用基础研究增加了强有力的手 段。MED19基因位于染色体的llql2. 1位置，编码一种与酵母中促进转录的转录介导 因子MED19同源的蛋白，在哺乳动物中尚无明确的功能报道。
技术实现思路
本专利技术人研究发现与正常组织相比，在肿瘤组织中MED19基因显著高表达；提示 MED19基因的表达可能与肿瘤的发生、发展密切相关。本专利技术提供了一系列干扰MED19基因 的有效靶点，构建了特异干扰人MED19基因的慢病毒。本专利技术人经过研究发现，针对人MED19基因设计的RNA干扰慢病毒，特异干扰并下 调MED19基因的表达后，可以抑制肿瘤细胞的生长、侵袭，促进肿瘤细胞的凋亡、抑制肿瘤 细胞成瘤。表明MED19基因可以为肿瘤治疗的靶点，下调MED19基因的表达有效地控制肿 瘤的进程(以肿瘤细胞AGS为例)。本专利技术的设计思路为通过免疫组织化学的方法检测MED19基因在肿瘤组织、正常组织和肿瘤周围正常 组织中的表达水平。研究发现MED19在肿瘤组织中的表达量显著高于正常组织和肿瘤周 围正常组织。提示MED19可能作为一种癌基因，在肿瘤的发生发展中发挥重要作用；降低 MED19的表达可能抑制肿瘤的进程；MED19可能成为肿瘤治疗的靶标；MED19基因的表达水 平可能成为肿瘤诊断的标志。本专利技术通过如下的方法来筛选获得一种人MED19基因RNA干扰慢病毒从 genebank中调取human MED19基因序列；预测siRNA位点；合成MED19基因的siRNA有效靴 点，两端含酶切位点粘端的双链DNA oligo ；慢病毒载体双酶切后与双链DNA oligo连接； 构建干扰序列的干扰慢病毒质粒及MED19过表达质粒；将干扰质粒与MED19过表达质粒共 转染293T细胞；Western-blot检测这些干扰质粒对MED19基因的蛋白表达水平的抑制作 用，筛选蛋白质水平抑制作用超过90%的干扰病毒；将该干扰质粒和慢病毒包装需要的23个辅助载体——pHelperl. 0载体和pHelper 2. 0载体共转染293T细胞后产生重组慢病毒 颗粒，即可制得高效干扰MED19基因的慢病毒。基于上述方法，本专利技术提供了一系列干扰MED19基因的有效靶点，构建了特异干 扰人MED19基因的慢病毒。同时本专利技术还公开一种人MED19基因RNA干扰慢病毒(GCG_973_siRNA)及其制备与应用。本研究发现利用慢病毒介导的RNA干扰方法降低MED19基因在肿瘤细胞中的 表达后，可以抑制肿瘤细胞的生长、侵袭，促进肿瘤细胞的凋亡、抑制肿瘤细胞成瘤。表明 MED19在肿瘤发生发展中具有重要的生物学功能，MED19基因可以为肿瘤治疗的靶标，针对 MED19基因特异性的沉默可作为肿瘤治疗的一种新型工具。本专利技术的第一方面，提供了一种人MED19基因在肿瘤治疗中的用途，即人MED19 基因在制备治疗或诊断肿瘤的药物或制剂中的应用。优选的，所述人MED19基因作为针对肿瘤细胞的作用靶标应用于制备治疗或诊断 肿瘤的药物或制剂。进一步优选的，所述针对肿瘤细胞的MED19基因作为RNA干扰作用靶标。本专利技术的第二方面，提供了一种人MED19基因的RNA干扰慢病毒，为将表达shRNA 的序列克隆入慢病毒载体后获得。优选的，所述表达shRNA的序列，包括两个短反向重复序列，中间由一茎环序列分 隔；其中，两个短反向重复序列分别为人MED19基因的siRNA靶点序列及其互补序列。更优选的，所述人MED19基因的siRNA靶点序列如SEQ ID NO 1所示。更优选的，所述表达shRNA的序列中的茎环序列优选如SEQ ID NO 2所示。进一步优选的，上述表达shRNA的序列的正义链序列如SEQ ID NO :3所示，反义链 序列如SEQ ID NO 4所示。所述表达shRNA的序列两端含限制性内切酶的酶切位点粘端。优选的，所述限制性内切酶的酶切位点粘端为Hpa I和Xho I的酶切位点粘端。优选的，所述慢病毒载体为pGCL-GFP (吉盛公司提供)。本专利技术中所述的人MED19基因RNA干扰慢病毒可以用于制备治疗或诊断肿瘤的药 物或制剂。同时该慢病毒也可以以组合物的形式用于制备治疗或诊断肿瘤的药物或制剂， 所述组合物含有0. 001 99. 999wt%如前所述的人MED19基因RNA干扰慢病毒以及可接受 的载体、稀释剂或赋形剂。较佳的，所述的组合物是药物组合物，并且所述的载体、稀释剂或赋形剂是药学上 可接受的载体、稀释剂或赋形剂。较佳的，所述的肿瘤包括结直肠癌、乳腺癌、前列腺癌、肝癌和肺癌。本专利技术基于MED19基因在多种恶性肿瘤中表达异常的这一发现，利用RNA干扰方 法下调MED19的表达能够有效地控制肿瘤进程，表明MED19基因可以为肿瘤治疗的靶点。针 对人MED19基因设计的RNA干扰慢病毒，在细胞内降低MED19基因的表达，可以抑制肿瘤细 胞的生长、侵袭，促进肿瘤细胞的凋亡、抑制肿瘤细胞成瘤。因此针对降低MED19的RNA的 表达可作为肿瘤基因治疗的方法之一。本专利技术的人MED19基因RNA干扰慢病毒在mRNA水 平的抑制效率大于90%，在蛋白质水平的抑制效率大于90%，试验表明它对肿瘤细胞的生长及转移有明显抑制作用。 附图说明图1 针对人MED19基因siRNA的设计及高效干扰慢病毒的制备及原理示意图。图2 免疫组织化学的方法检测正常增生组织和癌变的前列腺组织中MED19的表 达差异结果示意图；A为前列腺良性增生组织；B为前列腺癌组织。图3 =MTT法检测肿瘤细胞感染GCG-973-siRNA增殖能力结果示意图。图4 :BrdU法检测肿瘤细胞感染GCG-973-siRNA肿瘤细胞的增殖能力结果示意图。图5 流式细胞术(FACS)检测肿瘤细胞感染GCG_973_siRNA后细胞周期变化结果 示意图。图6 克隆形成实验检测肿瘤细胞感染GCG-973-siRNA后克隆形成能力结果示意 图。图7 =TTP检测肿瘤细胞感染GCG-973-siRNA后Control组的凋亡情况灰度直方 图。图8 =TTP检测肿瘤细胞感染GCG-973-siRNA后对照干扰(NC组)的凋亡情况灰度直方图。图9 =TTP检测肿瘤细胞感染GCG-973-siRNA后GCG-973-siRNA感染(KD组)的凋 亡情况灰度直方图。图10 =TTP检测肿瘤细胞感染GCG-973-siRNA后凋本文档来自技高网...

【技术保护点】
人ＭＥＤ１９基因在制备治疗或诊断肿瘤的药物或制剂中的应用。

【技术特征摘要】
人MED19基因在制备治疗或诊断肿瘤的药物或制剂中的应用。2.如权利要求1中所述人MED19基因的应用，其特征在于，所述人MED19基因作为针对 肿瘤细胞的作用靶标应用于制备治疗或诊断肿瘤的药物或制剂。3.如权利要求2中所述人MED19基因的应用，其特征在于，所述针对肿瘤细胞的作用靶 标为RNA干扰作用靶标。4.如权利要求1-3中任一所述人MED19基因的应用，其特征在于，所述的治疗或诊断肿 瘤的药物或制剂中，含有人MED19基因的RNA干扰慢病毒。5.一种人MED19基因的RNA干扰慢病毒，为将表达shRNA的序列克隆入慢病毒载体后 获得。6.如权利要求5中所述人MED19基因的RNA干扰慢病毒，其特征在于，所述表达shRNA 的序列包括两个短反向重复序列，中间由一...

【专利技术属性】
技术研发人员：韦有恒，劳昕元，季国庆，杨敏，高博，曹跃琼，
申请(专利权)人：上海吉凯基因化学技术有限公司，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]