【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于免疫诊断，具体涉及一种基于磁微粒化学发光免疫分析技术用于检测人畜布鲁氏菌抗体的试剂盒及其制备方法。
技术介绍
1、布鲁氏菌病又称布鲁菌病或布病，是由布鲁氏菌感染引起的传染病，是一种人畜共患的疾病，人畜共患病是某些可在人与动物间传播的病原体所引发的疾病，其流行趋势会严重影响到人类的健康和畜牧业的发展，造成经济损失。布鲁氏菌病的流行和传播非常广泛，几乎是呈全球性分布，有明确报告人感染布鲁氏菌病的国家(或地区)超170多个。布鲁氏菌病在我国被列为二类动物疫病，主要分布在甘肃、新疆、西藏等西部地区及内蒙古等地，以牧区为主，东部地区也时有发生传播和流行，全国有31个省市都出现过布鲁氏菌病的疫情，受其威胁人类达3.5亿，现有病例约50万，严重影响到我国人民身体健康，也制约着我国畜牧业的良性发展。目前随着养殖业的规模化生产，布鲁氏菌病出现了上升的趋势。
2、布鲁氏菌是一种胞内寄生革兰阴性菌。按感染宿主不同可将布鲁氏菌分为6类，分别为羊种布鲁氏菌(brucellamelitensis)、牛种布鲁氏菌(b.abortus)、猪种布鲁氏菌(b.suis)、绵羊附睾种布鲁氏菌(b.ovis)、犬种布鲁氏菌(b.canis)、沙林鼠种布鲁氏菌(b.neotomae)。前5种可感染人类，其中又属羊种布鲁氏菌的侵染性最强。常见布鲁氏菌感染的宿主除以上6种外，还发现在骆驼、马、麋鹿、野猪等动物中存在感染情况。春夏季节是布鲁氏菌病的高发期，与动物产仔时节基本同步，在我国牛和羊是布鲁氏菌最主要的宿主载体。
3、布鲁氏菌病的传
4、布鲁氏菌病是一种全身性疾病，可损害人体多个系统，其临床表现症状多样，没有特异性的指征，最常见的症状是发热，波状热是布鲁氏菌病患者典型的热型，同时伴有大汗。另外多数布鲁氏菌病患者均有乏力表现，还可出现骨关节和肌肉疼痛。当布鲁氏菌侵犯生殖系统时，男性可表现为附睾炎或睾丸炎，妊娠女性则可导致流产、早产甚至死胎现象。布鲁氏菌还可损害神经系统，甚至是中枢神经，可导致脑炎、脑膜炎等。
5、目前对于布鲁氏菌病的诊断方法主要包括病原学检测、血清学检测和分子生物学检测等。在实验室检测方法中，病原菌分离鉴定是诊断布鲁氏菌病的“金标准”，需要对病例样本进行采集、保存、分离、培养和鉴定等一系列较为繁杂的步骤，分离周期长，生物安全级别要求较高，并不利于基层实验室的推广应用，也不适合临床上的快速诊断。目前血清学检测方法是布鲁氏菌病诊断的主要手段，主要技术方法包括虎红平板凝集试验、血清凝集试验、补体结合试验、免疫层析实验、酶联免疫吸附试验等。分子诊断的方法对于布鲁氏菌的检测是较为新型的技术，主要有聚合酶链式反应(pcr)及核酸探针检测等，但分子诊断的方法相对成本较高，对操作人员要求也相对较高，对于活动性感染状态的诊断还存在一定的缺陷，目前对于商业化的推广存在一定难度，仅作为研究的一种手段而已。
6、在主要的几种血清学诊断方法中，虎红平板凝集试验是国际上公认的检验标准，其操作相对简便，敏感性较高，但特异性较低，易产生假阳性，因此可作为一种初筛方法；血清凝集试验是我国法定的确诊方法，但检验的通量低，操作需要一定的专业知识；补体结合试验的特异性较好，但操作较为繁琐，对于检测的条件也要求较高，不易大范围推广应用；免疫层析技术操作简便，检测快速，不需要大型仪器，对于样本的初筛检测具有一定价值，但该方法的灵敏度和特异性相对较低；酶联免疫吸附试验方法是一种较为成熟的免疫检测技术，其灵敏度和特异性都要强于以上各检测方法，但该方法对人员有一定专业要求，且不易开发成自动化检测产品。
7、磁微粒化学发光免疫分析技术是目前全球应用最为先进的免疫诊断技术，该技术结合了化学发光测定技术的超高灵敏度及免疫反应的高特异性，同时兼具检测范围宽、结果稳定、操作简单等非常优越的特点，目前已大范围应用各种疾病的诊断。磁微粒化学发光的最大特点是易实现自动化检测，极大降低了人力成本，减少了人为操作检测带来的误差和错误，进一步提高了检测结果的可靠性。目前在我国已取得布鲁氏菌病检测产品注册证的试剂数量共有11个，其中有胶体金检测方法的有5个，平板凝集法的有3个，试剂凝集法的有2个，另外1个为血琼脂法，未见有磁微粒化学发光检测方法的已注册产品。
技术实现思路
1、针对检测布鲁氏菌抗体现有技术存在的短板和缺点，本专利技术提供一种基于磁微粒化学发光免疫分析技术用于布鲁氏菌抗体检测的试剂盒及其制备方法，该试剂盒可同时检测人、羊、牛、猪等种属布鲁氏菌抗体，具有高灵敏度、高特异性，高稳定性，高通量等特点。
2、本专利技术提供了一种基于磁微粒化学发光免疫分析技术的检测人畜布鲁氏菌抗体的试剂盒，包括包被磁珠和吖啶酯标记物，所述包被磁珠为布鲁氏菌特异性脂多糖抗原包被的磁珠，所述布鲁氏菌特异性脂多糖抗原为天然提取纯化的布鲁氏菌细胞表面抗原，所述吖啶酯标记物包括ae-protein g，所述ae-protein g由吖啶酯盐nsp-sa-nhs通过与protein g进行共价偶联所得。
3、进一步优选，所述吖啶酯盐nsp-sa-nhs的cas号为199293-83-9，分子式为c32h31n3o10s2，分子量为681.73，所述protein g为g族链球菌细胞表面蛋白；所述天然提取纯化的布鲁氏菌细胞表面抗原的纯度不小于90％。
4、优选的，还包括磁珠试剂稀释液，所述磁珠试剂稀释液为含稳定剂和防腐剂的磁珠缓冲液，所述包被磁珠和磁珠试剂稀释液组成磁珠试剂，所述磁珠试剂中包被磁珠浓度为0.1-1.0mg/ml、稳定剂浓度为0.05-1.0w/v％、防腐剂浓度为0.02-0.1w/v％；
5、所述稳定剂为甘油、聚乙二醇、牛血清白蛋白和酪蛋白中的至少一种；
6、所述防腐剂为proclin300、proclin950和叠氮钠中的至少一种；
7、所述磁珠缓冲液为tris缓冲液、hepes缓冲液和磷酸盐缓冲液中的至少一种，浓度为0.01-0.1mol/l、ph为6.5-8.5。
8、优选的，所述包被磁珠由布鲁氏菌特异性脂多糖抗原与磁珠表面的偶联活性基团共价偶联所得；所述磁珠为复合材料制备而成的粒径均值为1.0～6.0μm的微球，微球分为三层结构，其中微球最内层为用于保持球形结构的内核粒子，材质为聚苯乙烯或聚丙烯；微球中间层为超顺磁性材料，超顺磁性材料为fe3o4或fe2o3，超顺磁性材料的大小为纳米级，超顺磁性材料含量占微球重量的20％～50％；微球最外层为亲水聚合物涂层，且涂层中嵌入了偶联活性基团本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.基于磁微粒化学发光免疫分析技术用于检测人畜布鲁氏菌抗体的试剂盒，其特征在于：包括包被磁珠和吖啶酯标记物，所述包被磁珠为布鲁氏菌特异性脂多糖抗原包被的磁珠，所述布鲁氏菌特异性脂多糖抗原为天然提取纯化的布鲁氏菌细胞表面抗原，所述吖啶酯标记物包括AE-Protein G，所述AE-Protein G由吖啶酯盐NSP-SA-NHS通过与Protein G进行共价偶联所得。
2.根据权利要求1所述基于磁微粒化学发光免疫分析技术用于检测人畜布鲁氏菌抗体的试剂盒，其特征在于：还包括磁珠试剂稀释液，所述磁珠试剂稀释液为含稳定剂和防腐剂的磁珠缓冲液，所述包被磁珠和磁珠试剂稀释液组成磁珠试剂，所述磁珠试剂中包被磁珠浓度为0.1-1.0mg/mL、稳定剂浓度为0.05-1.0w/v％、防腐剂浓度为0.02-0.1w/v％；
3.根据权利要求1所述基于磁微粒化学发光免疫分析技术用于检测人畜布鲁氏菌抗体的试剂盒，其特征在于：所述包被磁珠由布鲁氏菌特异性脂多糖抗原与磁珠表面的偶联活性基团共价偶联所得；所述磁珠为复合材料制备而成的粒径均值为1.0～6.0μm的微球，微球分为三层结构
4.根据权利要求1所述基于磁微粒化学发光免疫分析技术用于检测人畜布鲁氏菌抗体的试剂盒，其特征在于：还包括含保护剂和防腐剂的标记物缓冲液，所述AE-Protein G和含保护剂和防腐剂的标记物缓冲液组成吖啶酯标记物试剂，所述吖啶酯标记物试剂中AE-Protein G浓度为0.002-0.1μg/mL、保护剂浓度为0.05-5w/v％、防腐剂浓度为0.02-0.1w/v％；
5.根据权利要求1所述基于磁微粒化学发光免疫分析技术用于检测人畜布鲁氏菌抗体的试剂盒，其特征在于：还包括校准品、阳性对照品、阴性对照品、发光激发液和样本稀释液；
6.一种根据权利要求1-5任一所述基于磁微粒化学发光免疫分析技术用于检测人畜布鲁氏菌抗体的试剂盒的制备方法，其特征在于：所述制备方法包括包被磁珠的制备与分装、吖啶酯标记物的制备与分装、校准品的配制与分装、阴性对照品的配制与分装、阳性对照品的配制与分装、发光激发液的配制与分装、样本稀释液的配制与分装。
7.根据权利要求6所述基于磁微粒化学发光免疫分析技术用于检测人畜布鲁氏菌抗体的试剂盒的制备方法，其特征在于：所述包被磁珠的制备与分装：
8.根据权利要求6所述基于磁微粒化学发光免疫分析技术用于检测人畜布鲁氏菌抗体的试剂盒的制备方法，其特征在于：所述吖啶酯标记物的制备与分装包括以下步骤：
9.根据权利要求6所述基于磁微粒化学发光免疫分析技术用于检测人畜布鲁氏菌抗体的试剂盒的制备方法，其特征在于：
10.权利要求1-5所述试剂盒或权利要求6-9所述方法制得的试剂盒在以非诊断为目的检测人畜布鲁氏菌抗体中的应用，其特征在于：所述应用方法包括以下步骤：
...【技术特征摘要】
1.基于磁微粒化学发光免疫分析技术用于检测人畜布鲁氏菌抗体的试剂盒，其特征在于：包括包被磁珠和吖啶酯标记物，所述包被磁珠为布鲁氏菌特异性脂多糖抗原包被的磁珠，所述布鲁氏菌特异性脂多糖抗原为天然提取纯化的布鲁氏菌细胞表面抗原，所述吖啶酯标记物包括ae-protein g，所述ae-protein g由吖啶酯盐nsp-sa-nhs通过与protein g进行共价偶联所得。
2.根据权利要求1所述基于磁微粒化学发光免疫分析技术用于检测人畜布鲁氏菌抗体的试剂盒，其特征在于：还包括磁珠试剂稀释液，所述磁珠试剂稀释液为含稳定剂和防腐剂的磁珠缓冲液，所述包被磁珠和磁珠试剂稀释液组成磁珠试剂，所述磁珠试剂中包被磁珠浓度为0.1-1.0mg/ml、稳定剂浓度为0.05-1.0w/v％、防腐剂浓度为0.02-0.1w/v％；
3.根据权利要求1所述基于磁微粒化学发光免疫分析技术用于检测人畜布鲁氏菌抗体的试剂盒，其特征在于：所述包被磁珠由布鲁氏菌特异性脂多糖抗原与磁珠表面的偶联活性基团共价偶联所得；所述磁珠为复合材料制备而成的粒径均值为1.0～6.0μm的微球，微球分为三层结构，其中微球最内层为用于保持球形结构的内核粒子，材质为聚苯乙烯或聚丙烯；微球中间层为超顺磁性材料，超顺磁性材料为fe3o4或fe2o3，超顺磁性材料的大小为纳米级，超顺磁性材料含量占微球重量的20％～50％；微球最外层为亲水聚合物涂层，且涂层中嵌入了偶联活性基团，偶联活性基团为羧基或甲苯磺酰基，微球中偶联活性基团的浓度为5-20nmol/mg。
4.根据权利要求1所述基于磁微粒化学发光免疫分析技术用...
【专利技术属性】
技术研发人员：马秀敏，齐新伟，王亮，刘玉梅，温浩，王泉，冯宁，霍怡杉，沙若成，田凤鸣，张国军，
申请(专利权)人：新疆医科大学，
类型：发明
国别省市：
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