【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物医药领域，具体地涉及霍山石斛蛋白ppb3-ⅱ及其制备方法和应用。
技术介绍
1、糖尿病(diabetes mellitus，dm)是一种以血糖水平升高为特征，受环境、遗传及其他多种因素共同影响的代谢性疾病。2型糖尿病(t2dm)约占所有糖尿病病例的90％，主要是由机体对胰岛素正常作用的抵抗引起的。血糖水平升高往往导致各种并发症，包括心脑血管疾病和感觉神经病变，对人体健康构成重大威胁。α-葡萄糖苷酶抑制剂已成为有效治疗2型糖尿病的一线降糖药物。这些抑制剂的作用机制是削弱α-葡萄糖苷酶的活性，从而抑制双糖或低聚糖的水解。这延缓了碳水化合物的吸收，最终减少餐后高血糖。临床上，阿卡波糖和伏格列波糖是最常用的α-葡萄糖苷酶抑制剂。尽管这些药物有效，但由于患者长期使用后有明显的肠道副作用而受到应用限制。因此寻找替代或补充的抗糖尿病药物对全世界t2dm的管理具有巨大的兴趣和重要性。
2、长期以来，植物蛋白因其对代谢问题，特别是糖尿病的良好作用而受到关注并被用作药物。霍山石斛为兰科石斛属多年生草本植物，主产于安徽大别山地区，是我国名贵中药材之一。现代药理学研究表明，霍山石斛具有一系列的生理作用，包括抗氧化特性、增强免疫系统、保护肝脏、抗白内障活性、降低血糖水平等。这些积极作用通常归因于霍山石斛中多糖、黄酮类化合物和生物碱等活性成分的存在。与此同时，另一种有用的成分，蛋白质和多肽，却遭到了人们的忽视和抛弃。
3、公布号为cn116411039a的中国专利申请文献，公开了一种抑制α-葡萄糖苷酶的活性肽的制备
技术实现思路
1、本专利技术所要解决的技术问题在于如何提出一种具有α-葡萄糖苷酶抑制活性的霍山石斛蛋白。
2、本专利技术通过以下技术手段实现解决上述技术问题的：
3、采取上述技术方案的有益效果包括：本专利技术的第一方面提出一种霍山石斛蛋白ppb3-ⅱ的制备方法，包括以下步骤：
4、(1)采用硫酸铵沉淀法从霍山石斛中提取霍山石斛总蛋白dhpp；
5、(2)对dhpp进行超滤离心，获得不同分子量段的组分，根据分子量段从大到小分别命名为ppa至ppe组分，选择ppb(10-30kda)组分；
6、(3)采用deae纤维素阴离子交换层析法对ppb组分进行分离，根据洗脱液浓度及体积由小到大对应的出峰情况，分别命名为ppb1至ppb5组分，选择ppb3组分；
7、(4)采用葡聚糖凝胶sephadex g-75层析法对ppb3组分进行分离，根据洗脱液浓度及体积由小到大对应的出峰情况，分别命名为组分ppb3-ⅰ至ppb3-ⅲ组分；选择ppb3-ⅱ组分，即得。
8、有益效果：本专利技术通过分离纯化获得的ppb3-ⅱ蛋白，以霍山石斛蛋白为原料制备获得；经α-糖苷酶抑制活性检测，结果表明，对α-葡萄糖苷酶抑制活性的ic50值为34.20±2.93μg/ml，具有明显的α-葡萄糖苷酶抑制作用，可以用于制备降糖药物，用于防治糖尿病。
9、优选的，所述步骤(1)具体为：将霍山石斛鲜条茎粉碎，加水，加热提取，得霍山石斛水提液；加乙醇搅拌，静置后收集上清液；冷冻干燥，加水，离心，留上清液；加入硫酸铵，静置，离心，收集沉淀，即得。
10、优选的，所述步骤(2)中超滤离心具体为：采用3kda、10kda和30kda的高性能超滤离心管对dhpp溶液进行分级超滤。(得到了分子量范围分别为>30kda、10-30kda、3-10kda、1-3kda和<1kda的5个组分)
11、优选的，所述步骤(3)中deae纤维素阴离子交换层析的条件包括：分别用100mmtris-hcl(ph 8.0)和不同浓度的nacl溶液(0.25m、0.5m、0.7m和1.0m)进行洗脱，上样量为6ml，上样浓度为5mg/ml，流速为1.5ml/min。
12、优选的，所述步骤(4)中葡聚糖凝胶sephadex g-75层析条件包括：洗脱液为100mmtris-hcl(ph 8.0)，上样量为2ml，上样浓度为1mg/ml，洗脱流速为0.2ml/min。
13、本专利技术的第二方面提出采用上述制备方法制得的霍山石斛蛋白ppb3-ⅱ。
14、本专利技术的第三方面提出上述霍山石斛蛋白ppb3-ⅱ在下述的任一种应用：
15、1)在作为或制备α-葡萄糖苷酶抑制剂中的应用；
16、2)在制备降血糖药物、食品、保健品中的一种或几种的应用；
17、3)在制备预防和/或治疗糖尿病药物、食品、保健品中的一种或几种的应用。
18、本专利技术的第四方面提出一种具有α-葡萄糖苷酶抑制活性的产品，其活性成分包括上述霍山石斛蛋白ppb3-ⅱ。
19、优选的，所述产品为药物、食品或保健品。
20、优选的，所述产品为药物时，该药物还含有药学上可以接受的载体。
21、优选的，所述药学上可接受的载体选自稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体和润滑剂中的一种或多种。
22、优选的，制成药学上可以接受的剂型。
23、优选的，所述剂型为片剂、丸剂、膏剂、胶囊、口服液或冲剂。
24、本专利技术的优点在于：
25、1、本专利技术通过分离纯化获得的ppb3-ⅱ蛋白，以霍山石斛蛋白为原料制备获得；经α-糖苷酶抑制活性检测，结果表明，对α-葡萄糖苷酶抑制活性的ic50值为34.20±2.93μg/ml，具有明显的α-葡萄糖苷酶抑制作用，可以用于制备降糖药物，用于防治糖尿病，可以用于食品、药品、保健品等领域。
26、2、本专利技术证实了霍山石斛分离蛋白具有有效的α-葡萄糖苷酶抑制能力。进一步采用超滤结合deae阴离子交换层析及凝胶过滤层析三步纯化方法，筛选具有α-葡萄糖苷酶抑制作用的活性蛋白ppb3-ⅱ，并通过体外α-葡萄糖苷酶抑制实验进行验证。通过抑制动力学和荧光猝灭分析蛋白对α-葡萄糖苷酶的抑制作用，探讨其抑制机制。研究表明本专利技术提供的霍山石斛蛋白ppb3-ⅱ对α-葡萄糖苷酶具有显著的抑制作用，可以为开发新的降血糖的药物或健康产品提供理论依据。
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1.一种霍山石斛蛋白PPB3-Ⅱ的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的霍山石斛蛋白PPB3-Ⅱ的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)具体为：将霍山石斛鲜条茎粉碎，加水，加热提取，得霍山石斛水提液；加乙醇搅拌，静置后收集上清液；冷冻干燥，加水，离心，留上清液；加入硫酸铵，静置，离心，收集沉淀，即得。
3.根据权利要求1所述的霍山石斛蛋白PPB3-Ⅱ的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中超滤离心具体为：采用3kDa、10kDa和30kDa的高性能超滤离心管对DHPP溶液进行分级超滤。
4.根据权利要求1所述的霍山石斛蛋白PPB3-Ⅱ的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中DEAE纤维素阴离子交换层析的条件包括：分别用100mM Tris-HCl(pH 8.0)和不同浓度的NaCl溶液(0.25M、0.5M、0.7M和1.0M)进行洗脱，上样量为6mL，上样浓度为5mg/mL，流速为1.5mL/min。
5.根据权利要求1所述的霍山石斛蛋白PPB3-Ⅱ的制备方法，其特征在于，所述步骤(4)中葡聚糖凝胶Sepha
6.权利要求1-5任一项所述的制备方法制得的霍山石斛蛋白PPB3-Ⅱ。
7.权利要求6所述的霍山石斛蛋白PPB3-Ⅱ在下述的任一种应用：
8.一种具有α-葡萄糖苷酶抑制活性的产品，其特征在于，其活性成分包括权利要求6所述的霍山石斛蛋白PPB3-Ⅱ。
9.根据权利要求8所述的具有α-葡萄糖苷酶抑制活性的产品，其特征在于，所述产品为药物、食品或保健品。
10.根据权利要求9所述的具有α-葡萄糖苷酶抑制活性的产品，其特征在于，所述产品为药物时，该药物还含有药学上可以接受的载体。
...【技术特征摘要】
1.一种霍山石斛蛋白ppb3-ⅱ的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的霍山石斛蛋白ppb3-ⅱ的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)具体为：将霍山石斛鲜条茎粉碎，加水，加热提取，得霍山石斛水提液；加乙醇搅拌，静置后收集上清液；冷冻干燥，加水，离心，留上清液；加入硫酸铵，静置，离心，收集沉淀，即得。
3.根据权利要求1所述的霍山石斛蛋白ppb3-ⅱ的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中超滤离心具体为：采用3kda、10kda和30kda的高性能超滤离心管对dhpp溶液进行分级超滤。
4.根据权利要求1所述的霍山石斛蛋白ppb3-ⅱ的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中deae纤维素阴离子交换层析的条件包括：分别用100mm tris-hcl(ph 8.0)和不同浓度的nacl溶液(0.25m、0.5m、0.7m和1.0m)进行洗脱，上样量为6ml，上样浓度为5mg/ml...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈乃东，李娇，陶强，郝经文，曹皖雪，
申请(专利权)人：皖西学院，
类型：发明
国别省市：
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