【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因工程和药物筛选，尤其涉及酵母双杂交系统及其构建方法、用途、植物提取物的用途。
技术介绍
1、sars-cov-2（严重急性呼吸综合症冠状病毒2）是一种冠状病毒。sars-cov-2通过其表面的spike蛋白与宿主细胞表面的ace2受体结合，从而侵入细胞。这一结合过程是病毒感染和传播的关键步骤。因此，阻断spike蛋白与ace2受体的相互作用成为开发抗sars-cov-2治疗策略的重要目标。
2、目前，已有多种技术用于阻断spike蛋白与ace2受体的相互作用。其中，表面等离子共振（spr）和分子对接技术是常用的方法。spr技术通过实时监测分子间的相互作用，评估候选化合物对spike-ace2结合的阻断效果；分子对接技术通过计算模拟化合物与蛋白质之间的结合亲和力，预测其潜在的阻断效果。然而，这些方法主要在体外检测中取得了一定进展，但在细胞内环境中验证候选药物的有效性方面仍存在局限性，尤其是在细胞内检测和细胞膜上的检测中。
3、酵母双杂交系统（yeast two-hybrid，y2h）是一种广泛应用于研究蛋白质间相互作用的分子生物学工具。传统的y2h系统虽然在检测蛋白质相互作用方面表现出色，但其主要应用于细胞核内蛋白相互作用的检测，对于膜蛋白的相互作用研究存在一定的局限性。为了克服这一问题，改良的split-ubiquitin酵母双杂交系统应运而生。该系统通过将目标蛋白质与泛素的不同部分融合，当两个目标蛋白质相互作用时，泛素重新组合并被特定的酵母蛋白酶识别，从而激活下游报告基因的表达。此系统
4、尽管现有技术在蛋白质相互作用研究中取得了一定进展，但仍需要一种更加高效、特异性更高的筛选平台，以便快速筛选和鉴定具有潜在抗病毒活性的化合物。
5、中国专利申请202311256915.4公开的内容记载了s-rbd/ace2相互作用酵母双杂交模型以及构建方法，进一步观察该方案中的酵母双杂交模型可见，其在说明书第26段公开了酵母双杂交质粒分别为pgadt7和pgbkt7，其在说明书第29段公开了其感受态细胞为ah109酵母细胞，同时，该方案第26段选取的基因为s-rbd、ace2的全基因；
6、可见，尽管该方案公开了酵母双杂交模型在抗病毒药物验证方面的应用，但该方案的酵母双杂交模型中所提取的基因为全基因，与此同时其选择的质粒（载体）分别为pgadt7和pgbkt7，而pgadt7和pgbkt7是基于核内表达的载体，这意味着它们主要是为了促进在细胞核内的蛋白质相互作用而设计的。考虑到spike蛋白的受体结合域（rbd）以及ace2均在细胞膜上发挥作用，主要的相互作用发生在细胞表面，这两种载体的使用可能不能完全模拟sars-cov-2病毒的真实入侵过程。因此，使用这些核内表达系统的载体，可能导致对蛋白-蛋白相互作用环境的模拟不够准确，从而影响筛选结果的生物相关性和实用价值。相较之下，本方案使用的是膜系统的酵母双杂交技术，更能真实地模拟病毒与宿主细胞之间在细胞膜层面上的相互作用，从而为抗病毒药物的筛选提供了一个更为精确和实际的平台。
7、本方案需要解决的问题：如何提供一种新的模拟更加真实更加符合实际情况的酵母双杂交系统及构建方法。
技术实现思路
1、本申请的目的是提供一种酵母双杂交系统的构建方法，所述构建方法包括以下步骤：
2、步骤1：提取sars-cov-2的spike蛋白基因及人类的ace2基因；
3、步骤2：将spike蛋白基因、ace2基因分别克隆至酵母双杂交载体一、酵母双杂交载体二；
4、步骤3：将克隆有spike蛋白基因的酵母双杂交载体一、克隆有ace2基因的酵母双杂交载体二分别转化至同一感受态细胞或同种类的不同感受态细胞；
5、步骤4：将载有克隆有spike蛋白基因的酵母双杂交载体一、载有克隆有ace2基因的酵母双杂交载体二的同一感受态细胞或同种类的不同感受态细胞转移至培养基内，得到酵母双杂交系统。
6、优选地，步骤1中提取sars-cov-2的spike蛋白基因的方法为：
7、以含有sars-cov-2的spike蛋白基因的质粒为模板扩增得到sars-cov-2的spike蛋白基因；
8、扩增过程中所使用的上游引物为spike sense，其核苷酸序列如seq id no：1所示；
9、扩增过程中所使用的下游引物为spike antisense，其核苷酸序列如seq id no：2所示；
10、步骤1中提取人类的ace2基因的方法为：
11、以含有人类的ace2基因的质粒为模板扩增得到人类的ace2基因；
12、扩增过程中所使用的上游引物为ace2 sense，其核苷酸序列如seq id no：3所示；
13、扩增过程中所使用的下游引物为ace2 antisense，其核苷酸序列如seq id no：4所示。
14、优选地，步骤2中所述酵母双杂交载体一选自pbt3-suc、ppr3-c、px-cub-tf、ptf-cub-x、py-ha-nubg、pnubg-ha-y中的任一种；
15、所述酵母双杂交载体二选自pbt3-suc、ppr3-c、px-cub-tf、ptf-cub-x、py-ha-nubg、pnubg-ha-y中的任一种。
16、优选地，步骤3中，所述感受态细胞为nmy51感受态细胞。
17、优选地，扩增过程中所使用的上游引物为spike sense的温度为61.3℃，下游引物为spike antisense的温度为61.3℃；上游引物为ace2 sense的温度为62.4℃，下游引物为ace2 antisense的温度为60.9℃。
18、优选地，所述培养基为缺少色氨酸、亮氨酸的双缺培养基或缺少色氨酸、亮氨酸、组氨酸、腺嘌呤以及添加3-at的四缺培养基。
19、此外，本申请还公开了一种酵母双杂交系统，通过上述的酵母双杂交系统的构建方法制得。
20、此外，本申请还公开了如上述的酵母双杂交系统用于筛选抗sars-cov-2药物的用途。
21、优选地，所述抗sars-cov-2药物为植物提取物或氯喹。
22、此外，本申请还公开了如上述的植物提取物作为抗sars-cov-2药物的活性成分的用途。
23、优选地，所述植物提取物选自迷迭香提取物、大黄提取物、唐松草提取物、半枝莲提取物、莲子心提取物中的任一种。
24、优选地，所述植物提取物抗sars-cov-2的途径为：抑制spike蛋白与ace2之间的相互作用。
25、本申请的有益效果是：
26、1.真实性和生物相关性增强：现有技术中常用的酵母双杂交系本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种酵母双杂交系统的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的酵母双杂交系统的构建方法，其特征在于，步骤1中提取SARS-CoV-2的Spike蛋白基因的方法为：
3.根据权利要求1所述的酵母双杂交系统的构建方法，其特征在于，步骤2中所述酵母双杂交载体一选自pBT3-SUC、pPR3-C、pX-Cub-TF、pTF-Cub-X、pY-HA-NubG、pNubG-HA-Y中的任一种；
4.根据权利要求1所述的酵母双杂交系统的构建方法，其特征在于，步骤3中，所述感受态细胞为NMY51感受态细胞；
5.一种酵母双杂交系统，其特征在于，通过权利要求1-4中任一所述的酵母双杂交系统的构建方法制得。
6.如权利要求5所述的酵母双杂交系统用于筛选抗SARS-CoV-2药物的用途。
7.根据权利要求6所述的用途，其特征在于，所述抗SARS-CoV-2药物为植物提取物或氯喹。
【技术特征摘要】
1.一种酵母双杂交系统的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的酵母双杂交系统的构建方法，其特征在于，步骤1中提取sars-cov-2的spike蛋白基因的方法为：
3.根据权利要求1所述的酵母双杂交系统的构建方法，其特征在于，步骤2中所述酵母双杂交载体一选自pbt3-suc、ppr3-c、px-cub-tf、ptf-cub-x、py-ha-nubg、pnubg-ha-y中的任一种；...
【专利技术属性】
技术研发人员：郑俊霞，黄钰景，祖敦涛，田陈婧，杨健妮，陈文霖，段思妍，严顺欣，袁钰嘉，谢俊涛，于新，范红霞，周海波，孙平华，
申请(专利权)人：广东工业大学，
类型：发明
国别省市：
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