蛋白质磁性印迹纳米球的制备方法技术

一种蛋白质磁性印迹纳米球的制备方法，是以血红白蛋白、溶菌酶、血清蛋白中的一种为模板分子的蛋白质磁性印迹纳米球制备方法，包括有如下阶段：磁性纳米粒子的合成，磁性纳米粒子是表面包有二氧化硅的Ｆｅ↓［３］Ｏ↓［４］纳米粒子；磁球表面氨基硅烷化；用戊二醛连接蛋白；用硅烷化试剂固定模板蛋白的空间结构；碱洗脱磁球表面蛋白形成印迹位点。本发明专利技术制备的血红蛋白、溶菌酶、血清蛋白磁性纳米印迹聚合物微球，将分子印迹准确专一的识别特性和磁性纳米微球在外界磁场作用下迅速分离的特性相结合，集二者优点于一体，避免了复杂的离心操作，在细胞、蛋白质、核酸的分离，生物分子的检测，肿瘤诊断，药物靶向治疗中发挥了重大作用，在分离分析领域有着广泛的应用前景。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种蛋白质分子印迹聚合物的制备。特别是涉及一种对模板蛋白有一定 的特异性吸附性能，以磁性为载体可在外界磁场的作用下迅速分离，能够避免传统的离 心等复杂操作，使分离识别过程更加简化的。
技术介绍
分子印迹技术(Molecular Imprinting Technique, MIT)，是制备对特定目标分子(模 板分子也称印迹分子)具有特异预定选择性的高分子化合物一分子印迹聚合物 (Molecular Imprinted Polymers, MIPs)的技术(M. D. Yan, 0. Ramstrom， Ed.， Molecularly Imprinted Materials Science and Technology, Marcel Dekker， New York, 2005)。分子印迹聚合物它具有形状与底物分子相匹配的孔穴，而且有着特定排列的功 能基团可以与底物分子产生识别作用。分子印迹技术广泛应用于色谱填料、固相萃取、 模拟酶、催化，相似物分离识别、以及生物传感器等诸多领域(R. J. Ansell， D. Kriz, Mosbach, Curr. Opin. Biotechnol., 1996， 7， 89;赖家平，何锡文，郭洪声，梁宏，分 析化学，2001， 7， 836; K. Haupt， K. Mosbach， Chem. Rev. ， 2000， 100， 2495; D. Kriz， 0. Ramstrom, K. Mosbach, Anal. Chem., 1997， 69， A345; G. Wulff, Chem. Rev. ， 2002， 102， 1.)。对于一些低分子量，水溶性差的目标分子体系已经具备了成熟的分子印迹技 术，但是对于水溶性生物大分子蛋白质的研究工作有待于进一步发展，原因由于生物大 分子体积大而且空间结构变化复杂，使得印迹过程中很难合成有效的识别位点，不过经 过科学研究的不断尝试目前已经有一部分工作取得了可喜进展。制备蛋白质印迹聚合物 的方法一般分为包埋法、微球表面印迹法和抗原决定基法(A. Bossi， S. A. Piletsky，E. V. Piletska， P. G. Righetti, A. P. F. Turner. Anal. Chem. ， 2001， 73, 5281;F. Bonini, S. Piletsky, A. P. F. Turner, A. Speghini， A. Bossi. Biosens. Bioelect扁.，2007， 22， 2322; T. Shiomi， M. Matsui， F. Mizukami， K. Sakaguchi. Biomaterials， 2005， 26， 5564; A. Rachkov, N. Minoura. Biochim. Biophys. Acta, 2001， 1544, 255; H. Nishino， C. S. H腿g， K. J. Shea. Angew. Chem. Int. Ed., 2006, 45, 2392.)，其中微球表面印迹法应用广泛，在微球表面接枝印迹蛋白，从而在微球表 面形成蛋白质部分包埋得聚合物层，再通过洗脱形成与蛋白质结构相匹配的结合位点， 由于结合孔穴分布在微球表面，模板分子在吸附过程就会较快的接近识别位点，因而具 有较高的结合速率。文献中报道的方法大都是以硅球作为印迹载体，原因在于硅球具有 一定的硬度和粒径，具有一定的机械强度和稳定性。但是硅球由于粒径较大，比表面积 相对较低， 一些识别位点容易包埋其中，造成吸附容量较低，而且采用硅球作分离介质，会涉及离心分离等繁琐操作，不利于广泛应用。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是，提供一种对模板蛋白有一定的特异性吸附性能，以 磁性为载体可在外界磁场的作用下迅速分离，能够避免传统的离心等复杂操作，使分离 识别过程更加简化的。本专利技术所采用的技术方案是 一种，是以血红白 蛋白、溶菌酶、血清蛋白中的一种为模板分子的蛋白质磁性印迹纳米球制备方法，包括 有如下阶段(一) 磁性纳米粒子的合成；(二) 磁球表面氨基硅烷化；(三) 用戊二醛连接蛋白；(四) 用硅烷化试剂固定模板蛋白的空间结构；(五) 碱洗脱磁球表面蛋白形成印迹位点。所述的第(一)阶段是采用共沉淀的方法合成磁性纳米粒子，所述的共沉淀方法基 本反应方程式Fe2++2Fe3++80H—= Fe304+4H20，并由如下步骤得到磁性？^04纳米粒子(1) 将FeCl2，4H20和FeCl3*6H20置于氮气除氧的二次水中，搅拌溶解，其中 Fe37Fe2+=2: 1，为摩尔比；(2) 升高环境温度到8(TC以上，在氮气氛围下逐滴加入25%氨水溶液，并过量， 使0H—:Fe3+的摩尔比大于15，并机械搅拌反应进行30分钟，得到黑色磁性流体；(3) 冷却后用磁铁磁性分离将混合液分为两相，除去上层清液，得到黑色超顺磁性 FeA纳米粒子，用乙醇、超纯水清洗5 6次，真空干燥，得到磁性FeA纳米粒子。所述的磁性纳米粒子是表面包有二氧化硅的Fe304纳米粒子，是由如下步骤得到的(1) 将干燥的FeA溶于异丙醇溶液，异丙醇为溶剂，使Fe^完全分散，形成均匀 的溶液，再依次加入高纯水、NH3 H20，使溶液的pH〉11，超声30min;(2) 常温下加入四乙氧基硅垸化试剂(TEOS)，使四乙氧基硅烷化试剂的浓度范围 为0. 1%到5%，搅拌12 h，外加磁场进行磁性分离，高纯水洗至中性，真空干燥至粉末。所述的磁性纳米粒子的粒径约为12nm左右。第(二)阶段所述的磁球表面氨基硅垸化是以3—氨基丙基三乙氧基硅烷为试剂，在 二氧化硅磁性纳米球表面采用溶胶一凝胶法实现的，包括如下步骤(1) 二氧化硅磁性纳米球溶于甲醇和丙三醇的混合溶液，甲醇丙三醇=1: 1 (体 积比)，二氧化硅磁性纳米球能完全分散在甲醇和丙三醇混合溶剂中，超声30 min，没 有二氧化硅磁性纳米球沉淀；(2) 升高环境温度到80-90°C，依次加入高纯水和3—氨基丙基三乙氧基硅烷化试 剂，两者的体积比为l: 5即水3 —氨基丙基三乙氧基硅烷化试剂4: 5，反应体系中水 的含量<1%，机械搅拌反应3h后，磁性分离高纯水洗，甲醇洗，真空干燥。第(三)阶段所述的戊二醛是以共价键的方式与血红白蛋白、溶菌酶、血清蛋白表 面的氨基作用形成亚胺键，从而将模板蛋白固定在磁性纳米球表面，具体是将等体积含氨基衍生的二氧化硅磁性纳米球5%-10%和含196戊二醛的磷酸缓冲溶液(pH为5. 0-7. 0) 混合，在室温反应12h,磁性分离，大量水洗备用，得到醛基修饰氨基衍生FeA纳米球。 第(四)阶段所述的用硅垸化试剂固定模板蛋白的空间结构，包括如下步骤(1) 将醛基修饰的氨基衍生化的二氧化硅磁性纳米球加入到含有模板蛋白质(牛血 红蛋白或溶菌酶或血清白蛋白)的磷酸缓冲溶液，4'C振荡反应12h，外加磁场分离，水 洗；(2) 固定上模板蛋白的磁性纳米印迹聚合物球加入至pH为5. 0-7. 0的磷酸缓冲液， 并加入比例为1:1的丙基三甲氧基硅烷和本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种蛋白质磁性印迹纳米球的制备方法，其特征在于，是以血红白蛋白、溶菌酶、血清蛋白中的一种为模板分子的蛋白质磁性印迹纳米球制备方法，包括有如下阶段：　（一）磁性纳米粒子的合成；　（二）磁球表面氨基硅烷化；　（三）用戊二醛连接蛋白；　（四）用硅烷化试剂固定模板蛋白的空间结构；　（五）碱洗脱磁球表面蛋白形成印迹位点。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：陈朗星，王新，王莲艳，何锡文，张玉奎，王彦芬，
申请(专利权)人：南开大学，
类型：发明
国别省市：12[中国|天津]