一种用于多个基因片段组装的试剂及其组装方法技术

本发明专利技术公开了一种用于多个基因片段组装的试剂及其组装方法，具体涉及基因工程学技术领域，该试剂包括原料和缓冲液体系，所述原料包括T5DNA外切酶、DNA聚合酶、DNA连接酶以及dNTP，所述缓冲液体系为使原料共同发挥作用的混合缓冲液。将购买或配制T5exo、Taq聚合酶、T4连接酶时附带的缓冲液，按照1:2:3的体积比混合获得的混合缓冲液。本发明专利技术提供该试剂的配方及组装方法，摆脱对限制性内切酶的依赖，可以将外源片段插入到载体的任意位点，具有很好的通用性，以实现多个基因片段的高效和快速组装，在保证其效率高和操作简便的前提下，该试剂可以使组装过程在更低的温度下进行，进一步降低对实验设备的要求。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及基因工程学，具体涉及一种用于多个基因片段的试剂及其组装方法。

技术介绍

1、将一个或多个dna片段插入到各种类型的载体(如最常用的质粒载体)中，是分子生物学和基因工程中常用的操作。在代谢工程和合成生物学研究如火如荼的当下，这些操作的应用则更为广泛。最经典的操作是利用dna限制性内切酶将这些片段和载体处理成相互兼容的粘性末端，再在dna连接酶的作用下，使这些片段连接起来，这样的操作是直接和有效的。然而，当待插入的片段较长或数量较多时，这样的操作方法就变得步骤十分繁琐和效率低下。而且，还有可能因为这些序列中包含了大量的酶切位点，出现没有合适的酶可以使用的情形，使这些操作无法进行。

2、为此，研究者提出了不同的解决方法，例如不依赖于序列和连接的克隆技术(slic)和gatewaytm克隆技术等。这些方法也都曾被广泛使用。然而，这些方法都有一些明显的缺陷，限制了他们的更广泛使用。例如，在slic方法中，由于在体外时形成的重组质粒事实上并没有共价闭合，是仅靠相邻片段上互补的单链之间的氢键相互作用维系的，因此，稳定性较差。slic方法克隆的产本文档来自技高网...

【技术保护点】

1.一种用于多个基因片段组装的试剂，其特征在于：包括原料和缓冲液体系，所述原料包括T5 DNA外切酶、DNA聚合酶、DNA连接酶以及dNTP，所述缓冲液体系为使原料共同发挥作用的混合缓冲液。

2.根据权利要求1所述的一种用于多个基因片段组装的试剂，其特征在于：将购买或配制T5 exo、Taq聚合酶、T4连接酶时附带的缓冲液，按照1:2:3的体积比混合获得的混合缓冲液。

3.根据权利要求1所述的一种用于多个基因片段组装的试剂，其特征在于：T5 DNA外切酶是能从双链DNA的磷酸基团一端以外切方式降解其中一条DNA链的任意酶；DNA聚合酶为具有按磷酸基团一端至羟基一端...

【技术特征摘要】

1.一种用于多个基因片段组装的试剂，其特征在于：包括原料和缓冲液体系，所述原料包括t5 dna外切酶、dna聚合酶、dna连接酶以及dntp，所述缓冲液体系为使原料共同发挥作用的混合缓冲液。

2.根据权利要求1所述的一种用于多个基因片段组装的试剂，其特征在于：将购买或配制t5 exo、taq聚合酶、t4连接酶时附带的缓冲液，按照1:2:3的体积比混合获得的混合缓冲液。

3.根据权利要求1所述的一种用于多个基因片段组装的试剂，其特征在于：t5 dna外切酶是能从双链dna的磷酸基团一端以外切方式降解其中一条dna链的任意酶；dna聚合酶为具有按磷酸基团一端至羟基一端方向以核苷酸为原料将dna单链进行延伸的任何酶；dna连接酶为可催化相邻核苷酸上的羟基及磷酸形成磷脂键的任意酶。

4.根据权利要求3所述的一种用于多个基因片段组装的试剂，其特征在于：t5 dna外切酶的浓度为1u/ml-10u/ml；dna聚合酶的活性为10u/ml-30u/ml；dna连接酶的活性达到500u/ml-700u/ml；dntp包括相同浓度的datp,dttp,dctp,dgtp，各dntp的终浓度为0.1m...

【专利技术属性】
技术研发人员：王天文，方天志，邵雅萍，薛正莲，
申请(专利权)人：安徽工程大学，
类型：发明
国别省市：