【技术实现步骤摘要】
专利
本专利技术涉及用于生成异二聚体蛋白的体外方法，其包括在还原性条件下温育第一和第二同二聚体蛋白的第一步和使从第一步获得的组合物经受氧化条件的第二步。本专利技术的方法特别适合于包含抗体的异二聚体蛋白的大规模生产。
技术介绍
0、专利技术背景
1、近年来单克隆抗体已成为成功的治疗分子，特别是用于治疗癌症。双特异性抗体可进一步能够提高单克隆抗体疗法的效力和功效，例如它们可以用于将药物或毒性化合物引导至靶细胞，用于将效应器机制再引导至疾病相关部位或提高对肿瘤细胞的特异性，例如通过与只见于肿瘤细胞的靶分子的组合结合。此外，通过在一种双特异性抗体中组合两种单克隆抗体的特异性可以潜在连结较大的一批作用机制，即其组合的作用机制。
2、最近chames and baty(2009)curr opin drug disc dev 12:276已经综述了关于双特异性抗体的不同形式和用途。开发双特异性抗体的主要障碍之一是通过传统技术难以制备足够质量和数量的材料，所述传统技术诸如杂交杂交瘤和化学缀合方法(marvin andzhu(2005)acta pharmacol sin 26:649)。由不同重链和轻链组成的两种抗体在宿主细胞中的共表达，除了产生期望的双特异性抗体以外，还产生可能的抗体产物的混合物。
3、已描述数种策略以利于在不同抗体构建体共表达后形成异二聚的(即双特异性)产物。
4、lindhofer等(1995j immunol 155:219)公开了大鼠/小鼠四源杂交瘤(quadro
5、用于形成双特异性抗性的技术是所谓的“隆突-入-空穴(knob-into-hole)”策略(美国专利5,731,168)。ep1870459(chugai)和wo 2009089004(amgen)描述了有利于在不同抗体域在宿主细胞中共表达后形成异二聚体的其它策略。在这些方法中，构成重链恒定域3(ch3)，即两个ch3域中的ch3-ch3界面的一个或更多个残基被荷电氨基酸置换，使得在静电上不利于形成同二聚体且在静电上利于异二聚体化。wo2007110205(merck)描述了又一种策略，其中利用iga与igg ch3域之间的差异促使异二聚体化。
6、dall’acqua等(1998biochemistry 37:9266)已鉴定五个参与ch3同二聚体界面处的ch3-ch3接触的在能量上关键的氨基酸残基(366、368、405、407和409)。
7、wo 2008119353(genmab)描述了用于抗体生成的离体方法。
8、wo 11/131746(genmab)公开了含有抗体fc的异二聚体蛋白及其生成方法。
9、本专利技术涉及用于生成异二聚体蛋白，诸如稳定的igg1双特异性抗体的方法，其中所述方法特别适合于稳定的异二聚体蛋白的大规模生产，其中将二硫键再氧化。通过在同二聚体的ch3域中引入不对称的突变，可以迫使fab臂交换反应由于ch3域的互补性而变为方向性的，且由此产生高度稳定的异二聚体蛋白。
技术实现思路
0、专利技术概述
1、在一个方面，本专利技术涉及用于生成异二聚体蛋白的体外方法，其包括下列步骤：
2、a)在还原性条件下将第一同二聚体蛋白与第二同二聚体蛋白一起温育，所述还原性条件足以容许铰链区中的链间二硫键还原，且
3、其中所述第一同二聚体蛋白包含免疫球蛋白的fc区，所述fc区包含第一ch3区，且所述第二同二聚体蛋白包含免疫球蛋白的fc区，所述fc区包含第二ch3区，且其中所述第一和第二ch3区的序列是不同的，并且使得所述第一和第二ch3区之间的异二聚体相互作用强于所述第一和第二ch3区各自的同二聚体相互作用，
4、b)使从步骤a)获得的组合物经受氧化条件，所述氧化条件足以容许所述异二聚体蛋白中的半胱氨酸氧化成链间二硫键。
5、在另一个方面，本专利技术步骤a)用下列步骤替换：
6、x)提供编码包含第一免疫球蛋白的fc区的第一多肽的第一核酸构建体，所述第一fc区包含第一ch3区，
7、y)提供编码包含第二免疫球蛋白的fc区的第二多肽的第二核酸构建体，所述第二fc区包含第一ch3区，
8、其中所述第一和第二ch3区的序列是不同的，并且使得所述第一和第二ch3区之间的异二聚体相互作用强于所述第一和第二ch3区各自的同二聚体相互作用，且
9、其中所述第一同二聚体蛋白在位置409处具有除了lys、leu或met外的氨基酸，且所述第二同二聚体蛋白具有选自下组的位置处的氨基酸取代：366、368、370、399、405和407，
10、和/或
11、其中所述第一和第二ch3区的序列使得在如实施例21中描述的那样测定时，每个所述ch3区的同二聚体相互作用的解离常数介于0.01和10微摩尔，诸如介于0.05和10微摩尔之间，更优选介于0.01和5之间，诸如介于0.05和5微摩尔之间，甚至更优选介于0.01和1微摩尔之间，诸如介于0.05和1微摩尔之间，介于0.01和0.5之间或介于0.01和0.1之间，
12、z)在宿主细胞中共表达所述第一和第二核酸构建体。
13、本专利技术还涉及以下实施方案：
14、1.一种用于生成异二聚体蛋白的体外方法，其包括下列步骤：
15、a)在还原性条件下将第一同二聚体蛋白与第二同二聚体蛋白一起温育，所述还原性条件足以容许铰链区中的链间二硫键还原，且
16、其中所述第一同二聚体蛋白包含免疫球蛋白的fc区，所述fc区包含第一ch3区，且所述第二同二聚体蛋白包含免疫球蛋白的fc区，所述fc区包含第二ch3区，且其中所述第一和第二ch3区的序列是不同的，并且使得所述第一和第二ch3区之间的异二聚体相互作用强于所述第一和第二ch3区各自的同二聚体相互作用，
17、b)使从步骤a)获得的组合物经受氧化条件，所述氧化条件足以容许所述异二聚体蛋白中的半胱氨酸氧化成链间二硫键。
18、2.依照实施方案1的体外方法，其中步骤b)包括使至少10ml从步骤a)获得的组合物经受足以容许氧化的氧化条件。
19、3.依照前述实施方案中任一项的体外方法，其中所述方法进一步包括如下步骤：
20、c)获得所述异二聚体蛋白。
21、4.依照前述实施方案中任一项的体外方法，其中步骤a)中的所述还原性条件包括添加还原剂。
22、5.依照实施方案4的体外方法，其中所述还原剂选自下组：2-巯基乙胺、2-巯基乙胺的化学衍生物、l-半胱氨酸和d-半胱氨酸。
23、6.依照前述实施方案中任一项的体外方法，其中步骤a)包括添加金属螯合剂。
24、7.依照实施方案6的体外方法，其中所述金属螯合剂是edta、egta或柠檬酸。
25、8.依照前述实施方案中任一项本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种用于生成异二聚体蛋白的体外方法，其包括下列步骤：
2.依照权利要求1的体外方法，其中步骤b)包括使至少10mL从步骤a)获得的组合物经受足以容许氧化的氧化条件。
3.依照前述权利要求中任一项的体外方法，其中所述方法进一步包括如下步骤：
4.依照前述权利要求中任一项的体外方法，其中步骤a)中的所述还原性条件包括添加还原剂。
5.依照权利要求4的体外方法，其中所述还原剂选自下组：2-巯基乙胺、2-巯基乙胺的化学衍生物、L-半胱氨酸和D-半胱氨酸。
6.依照前述权利要求中任一项的体外方法，其中步骤a)包括添加金属螯合剂。
7.依照权利要求6的体外方法，其中所述金属螯合剂是EDTA、EGTA或柠檬酸。
8.依照前述权利要求中任一项的体外方法，其中步骤a)中的所述还原性条件包括减少步骤a)中的组合物中的氧量。
9.依照前述权利要求中任一项的体外方法，其中在还原性条件下实施步骤a)，所述还原性条件具有介于-150和-600mV之间，诸如介于-350和-450mV之间的氧化还原电势。
...【技术特征摘要】
1.一种用于生成异二聚体蛋白的体外方法，其包括下列步骤：
2.依照权利要求1的体外方法，其中步骤b)包括使至少10ml从步骤a)获得的组合物经受足以容许氧化的氧化条件。
3.依照前述权利要求中任一项的体外方法，其中所述方法进一步包括如下步骤：
4.依照前述权利要求中任一项的体外方法，其中步骤a)中的所述还原性条件包括添加还原剂。
5.依照权利要求4的体外方法，其中所述还原剂选自下组：2-巯基乙胺、2-巯基乙胺的化学衍生物、l-半胱氨酸和d-半胱氨酸。
6.依照前述权利要求中任一项的体外方法，其中步骤a)包括添加金属螯合剂。<...
【专利技术属性】
技术研发人员：M·格雷默，A·昆杜，E·T·J·范登布雷默，M·范坎彭，P·普赖姆，A·F·拉布里杰恩，J·I·美斯特斯，J·J·内杰森，J·舒尔曼，P·帕伦，P·范博凯尔，W·L·沃斯，A·格里特森，
申请(专利权)人：健玛保，
类型：发明
国别省市：
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