本发明专利技术涉及一种利用乳酸杆菌和酵母菌生产功能性微生物制剂的制备方法，其特征在于，采用有益菌株的液体培养；离心收集菌体细胞壁；然后将菌群进行固体扩大培养，在培养物中添加收集富含多糖的细胞壁。本发明专利技术的优点是产品中的高浓度乳酸菌能显著提高养殖动物的消化吸收功能，同时产生的代谢产物如肽聚糖增加了动物对病原体的免疫能力；产品中高浓度的酵母菌能提高动物生长需要的丰富的单细胞蛋白，同时，酵母细胞被充分破壁，释放出大量的β－１，３葡聚糖，显著提高对革兰氏阳性和阴性菌的免疫能力，采用粮食作物和常用饲料载体作为主要培养基原料，降低了生产成本，易于在动物养殖中推广。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及，该制剂可用于促进养殖动物生长、提高养殖动物的免疫能力，属于农业生物制品
技术介绍
多年来，由于我国动物养殖业的低成本急剧扩张，从而形成了饲养环境失控、动物 免疫机能下降、疾病发生率不断高攀的格局。 自1929年英国Fleming发现抗生素以来，并被广泛地应用于养殖业，大大地提高 了养殖业的生产水平。但由于人们过分追求养殖的经济效益，致使抗生素、激素类以及化学 合成药物等各种饲料添加剂的用量成倍增加，形成了"高营养水平+高剂量药物"的饲养模 式，使动物机体免疫系统功能不全而必须依赖抗生素等物质才能抵御感染的局面，最终成 为一种恶性循环，造成了①饲料中的抗生素和药物通过食物链逐级富集，增强了其毒性和 危害；②在畜产品中抗生素和药物残留，细菌的耐药性提高、严重危害了人体健康。据报道， 仅1992年全美就有13300名患者死于抗生素耐药性细菌感染。在国内，磺胺类、四环素类、 青霉素、氯霉素、卡那霉素、庆大霉素等药物，在畜禽中已产生严重的抗药性，临床效果越来 越差，使用剂量随之增加；③由于氮、磷、铜、锌及药物添加剂排出养殖动物体内后，造成了 对环境的污染，致使土壤和地下水质恶化、释放出各种恶臭等。据专家预测，一个万头猪场 按美国FDA允许使用的砷制剂剂量推算，若连续使用含砷的加药饲料，5 8年之后将可能 向猪场周边排放近lt砷，16年后土壤中砷含量即上升0. 28mg/kg，按此计算不出10年，该 地所产甘薯中砷含量会全部超过国家食品卫生标准，这片耕地只能废弃或种其它作物； 造成动物机体的免疫力下降，引起内源性感染。震惊世界的英国"疯牛病"事件、比利时"二 恶英污染(dioxin)"事件、法国"污水饲料事件"和供港猪的"盐酸克伦特罗"事件，唤起了 人们对畜产品安全性的高度重视。 在当前的严峻形势下，对于既有提高动物免疫力效能，又可促进动物生长、安全无 害的新型产品的开发就显得日益迫切。而通过有益微生物及其代谢产物在水体及代谢产 物在动物养殖中的利用，可提高养殖动物的消化吸收能力，促进其生长，同时抑制肠道内致 病菌的大量繁殖，增强机体免疫力，这是一种治本的处理方法，也是推行绿色养殖的最佳措 施。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种提高养殖动物免疫能力和消化吸收能力的利用乳酸杆 菌和酵母菌生产功能性微生物制剂的制备方法。 为实现以上目的，本专利技术的技术方案是提供一种利用乳酸杆菌和酵母菌生产功能 性微生物制剂的制备方法，其特征在于，采用液体高速培养和固体扩大结合的发酵方法，其 生产步骤为 第一步发酵菌株来源及培养 a.菌株来源本专利技术的植物乳酸杆菌和酵母菌均来源农业部微生物菌种保藏 中心，其中植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)，菌种编号ACCC10533，啤酒酵母菌 (Saccharomyces cerevisiae)，菌禾中编号ACCC20065 ; b.将植物乳杆菌和酿酒酵母菌分别接种于肉汤培养基中，在35-4(TC温度下培养 20-25小时，然后将酿酒酵母菌接种于酵母膏麦芽汁琼脂培养基，将植物乳杆菌接种于乳酸 菌培养基中，进行划线培养，选出生长快、菌体特征明显的植物乳杆菌、酿酒酵母菌分别在 实验室中保存； c.生产制种最后将选出生长快的植物乳杆菌转接入装有营养琼脂培养基的茄 子瓶中，将酿酒酵母菌转接入酵母膏麦芽汁琼脂作培养基的茄子瓶中，在35-4(TC温度下培 养45-50小时，待茄子瓶表面菌苔布满，并白中带黄时即可取出，然后放入2-6°C的冰箱中 进行保存； 第二步有益菌株的液体培养 a.按以下重量配比例称取各菌种植物乳杆菌55-60%、酿酒酵母菌40-45% b.将称取的植物乳杆菌和酿酒酵母菌混合在一起进行复合培养步骤a中称取的 混合菌苔按1 : 25-30的比例接种于120-13(TC、30-45min高温灭菌的液体培养基中，在发 酵罐中搅拌30min，其转速为200-240r/min，搅拌均匀后放入消毒后塑料桶中静置5_7天， 静置过程中每天测定pH值并释放产出的气体； c.发酵过程中抽样3次，显微镜下检测菌体生长情况和测定pH值，当活菌总数达 到20亿/ml浓度和pH值达到3. 0-4. 0时停止发酵; 第三步离心收集菌体细胞壁 a.将步骤1中发酵液在离心机以8000r/min， lOmin离心收集菌体沉淀，用0. 9% 生理盐水反复洗涤细菌至白色，将菌体悬浮于蒸馏水中，然后用超声波细胞破碎机处理 30-40min，进行物理破碎2_4次； b.细胞壁分离将物理破碎后的溶液在离心机以每4000r/min离心15-20min，移 去沉淀物，以去除未破碎菌体，再将上清夜在离心机以每8000r/min离心20min，收集沉淀 的粗细胞壁； 第四步菌群的固体扩大培养 a.将步骤2复合培养的菌液混合按1 : 25-30的比例接入120_13(TC、30_45min 高温灭菌的固体扩大培养基中，搅拌30-45min至均匀，倒入50_70kg消毒双层饲料袋中密 封发酵，温度30-35°C ，时间8-10天，发酵过程中取样三次，测定水分和pH值，发酵结束后取 样，测定水分为35-40%、pH值为3. 5-4.0 ; b.添加粗细胞壁将细胞壁收集物与固体扩大发酵物按l : 50-60比例混合，倒 在搅拌机中搅拌，转速为150-200转/min，搅拌时间为30min ; 第五步干燥及粉碎过筛 a.干燥将步骤4发酵完全的产品按时间先后放入培养箱干燥，温度控制在 40-45t:，时间14-16小时，干燥完成的物料水份控制在《12% ; b.粉碎过筛将干燥后的产品转入粉碎机进行粉碎，物料温度控制在45t:以下， 粉碎后的物料过50目筛网，筛后粗料重新粉碎； c.过筛后装入带有内袋的桶或袋中，扎紧袋口，系好标识牌，转入成品库有序堆 放；取样检测，主要参数水份《12%、活菌数60-80亿/g ;物理性状深黄色粉末状固体。 所述的步骤2液体培养基为无菌水再加豆粕粉、尿素、硫酸铵、酵母粉、玉米粉、糖 蜜、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、磷酸镁、硫酸镁的至少三种混合物，其重量百分配比为豆粕 2-6 % 、尿素1-3 % 、硫酸铵0-1 % 、酵母粉0-3 % 、玉米粉2-8 % 、糖蜜10-20 % 、磷酸二氢钾 0-1 % 、磷酸二氢钠0-2% 、磷酸镁0-1 % 、硫酸镁0-1 % 、无菌水54-84% 。 所述的步骤4的固体扩大培养基为清糠和无菌水再加豆粕粉、糖蜜、玉米粉、磷酸 二氢钾、磷酸二氢钠、硫酸镁、无菌水10_30%、尿素中的至少四种混合物组成，其重量百分 配比为豆粕2-6 % 、糖蜜8-12 % 、玉米粉4-8 % 、清糠40-70 % 、磷酸二氢钾0. 03-0. 06 % 、 磷酸二氢钠1_2%、硫酸镁0. 4-0.8%、尿素1-2%、无菌水15-45%。 非特异性防御机制是脊椎动物抵抗病原体微生物感染的第一道防线系指机体组 织和体液中大量的细胞和抗菌的蛋白质、肽类。在微生物细胞中，同样存在着这些可被养 殖动物直接吸收利用的肽类及多糖，如肽聚糖和葡聚糖等，肽聚糖(PG)存在于革兰氏阳性 菌和革兰氏阴性菌的细胞壁中，是由N-乙酰葡萄糖胺和N-乙酰胞壁酸形本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种利用乳酸杆菌和酵母菌生产功能性微生物制剂的制备方法，其特征在于，采用液体高速培养和固体扩大结合的发酵方法，其生产步骤为：第一步：发酵菌株选育ａ．菌株来源：本专利技术的植物乳酸杆菌和酵母菌均来源农业部微生物菌种保藏中心，其中植物乳杆菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｐｌａｎｔａｒｕｍ），菌种编号：ＡＣＣＣ１０５３３，啤酒酵母菌（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ），菌种编号：ＡＣＣＣ２００６５；ｂ．将分离的植物乳杆菌和酿酒酵母菌分别接种于肉汤培养基中，在３５－４０℃温度完全的产品按时间先后放入培养箱干燥，温度控制在４０－４５度，时间１４－１６小时，干燥完成的物料水份控制在≤１２％；ｂ．粉碎过筛：将干燥后的产品转入粉碎机进行粉碎，物料温度控制在４５℃以下，粉碎后的物料过５０目筛网，筛后粗料重新粉碎；ｃ．过筛后装入带有内袋的桶或袋中，扎紧袋口，系好标识牌，转入成品库有序堆放；取样检测，主要参数：水份≤１２％、活菌数６０－８０亿／ｇ；物理性状：深黄色粉末状固体。下培养２０－２５小时，然后将酿酒酵母菌接种于酵母膏麦芽汁琼脂培养基，将植物乳杆菌接种于乳酸菌培养基中，进行划线培养，选出生长快、菌体特征明显的植物乳杆菌、酿酒酵母菌分别在实验室中保存；ｃ．生产制种：最后将选出生长快的植物乳杆菌转接入装有营养琼脂培养基的茄子瓶中，将酿酒酵母菌转接入酵母膏麦芽汁琼脂作培养基的茄子瓶中，在３５－４０℃温度下培养４５－５０小时，待茄子瓶表面菌苔布满，并白中带黄时即可取出，然后放入２－６℃的冰箱中进行保存；第二步：有益菌株的液体培养ａ．按以下重量配比例称取各菌种：植物乳杆菌５５－６０％、酿酒酵母菌４０－４５％；ｂ．将称取的植物乳杆菌和酿酒酵母菌混合在一起进行复合培养：步骤ａ中称取的混合菌苔按１∶２５－３０的比例接种于１２０－１３０℃高温灭菌的液体培养基中，在发酵罐中搅拌３０ｍｉｎ，其转速为２００－２４０ｒ／ｍｉｎ，搅拌均匀后放入消毒后塑料桶中静置５－７天，静置过程中每天测定ｐＨ值并释放产出的气体；ｃ．发酵过程中抽样３次，显微镜下检测菌体生长情况和测定Ｐｈ值，当活菌总数达到２０亿／ｍｌ浓度和ｐＨ值达到３．０－４．０时停止发酵；第三步：离心收集菌体细胞壁ａ．将步骤１中发酵液在离心机以８０００ｒ／ｍｉｎ，１０ｍｉｎ离心收集菌体沉淀，用０．９％生理盐水反复洗涤细菌至白色，将菌体悬浮于蒸馏水中，然后用超声波细胞破碎机处理３０－４０ｍｉｎ，进...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：江瀚，
申请(专利权)人：上海恩创生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]
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