一种金包覆磁粒原位引发高灵敏化学发光检测大肠杆菌的新方法技术

本发明专利技术公开了一种超灵敏、速度快、低成本、容易实现自动化的检测大肠杆菌的方法，其基本原理是：首先利用金包覆磁性粒子，负载第一抗体，再利用免疫夹心方式，捕获待检测抗原与第二抗体；在外加磁场的作用下，抗原抗体与金磁粒形成的复合物可被分离；在含有（ＨＣｌ－ＮａＣｌ－Ｂｒ↓［２］）强氧化剂的溶液中，将金磁粒表面的Ａｕ单质氧化成Ａｕ↑［３＋］，由于抗原抗体夹心结构呈强负电性，可将游离的Ａｕ↑［３＋］定量吸附在其周围。随后加入一定量的鲁米诺，在磁粒周围原位引发化学发光，并迅速测定化学发光强度，以此来定量大肠杆菌。该生物传感器体系基于金包覆磁粒原位氧化提供金离子源增敏增效，利用磁粒捕获与富集待分析样本的特定互补配对的生物分子大肠杆菌Ｏ１５７：Ｈ７抗原，产生化学发光的生物分子识别体系。免去了第二抗体纳米金标记的繁琐与非特异干扰，可用于大肠杆菌的快速超灵敏检测。此方法快速、直观，是一种操作简单、快速、高效率的新型大肠杆菌检测方法。

A new method for detection of Escherichia coli with gold coated magnetic particles in situ and highly sensitive chemiluminescence detection

The invention discloses an ultra sensitive, fast speed, low cost, easy to realize automatic method for detection of Escherichia coli, its basic principle is: first using gold coated magnetic particles, load the first antibody, then using immuno sandwich mode, capture the detected antigen and antibody of second; in the external magnetic field, composite antigen antibody and gold magnetic particle formation can be separated; in the presence of (HCl - NaCl - Br: 2) the solution of strong oxidant, Au elemental gold oxide magnetic particles into Au = 3 +, as the antigen antibody sandwich structure has a strong negative electricity, can be free Au = 3 + was quantitatively adsorbed around it. Subsequently, a certain amount of Lumino was added to produce the chemiluminescence in situ around the magnetic particle, and the chemiluminescence intensity was measured rapidly to quantify E. coli. The biosensor system of gold coated magnetic particles in situ oxidation of gold ion source to provide synergistic use of biological molecules based on Escherichia coli O157:H7 antigen specific complementary magnetic particle capture and enrichment to be analyzed sample pairing, biological molecular recognition chemiluminescence system. It eliminates the tedious and non-specific interference of second antibody gold nanoparticles labeling, and can be used for rapid and ultrasensitive detection of Escherichia coli. This method is rapid and direct, and it is a simple, fast and efficient method for detection of E. coli.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及。
技术介绍
大肠杆菌0157:H7感染性腹泻是近年来新发现的危害严重的肠道传染病，它除引起腹泻、 出血性肠炎外，还可发生溶血性尿毒综合症(HUS)、血栓性血小板减少性紫癜(TTP)等严重的 并发征，后者病情凶险，病死率高。研究发现只要有10个大肠杆菌O157:H7就足以致病。 目前，有关大肠杆菌的检测方法已经有诸多报道。常用的大肠杆菌0157:H7检测方法主要有 三类细菌学分离、免疫学检测以及分子生物学检测。国内外有关研究生物传感器对大肠杆菌进行检测的方法中，其中较为典型的是一种基于 金纳米微粒的化学发光免疫分析法。该方法基于金纳米微粒溶解的化学发光反应体系，探讨 了金纳米微粒溶解及化学发光测定的最佳条件。它是将原始抗体固定在磁珠上，二级抗体修 饰在胶体金上，然后通过夹心法的方式捕获目标生物分子等形成含有多抗的复合物，再化学 处理氧化使得磁珠表面的Au氧化成A^+，加入鲁米诺(Luminol，发光胺)引发化学发光， 从而应用化学发光免疫测定方法测定人类免疫血球蛋白G，利用这一方法即可制造出测定人 类免疫血球蛋白G的生物传感器。受此启发，本专利技术目的是本着建立一种超灵敏、速度快、低成本、容易实现自动化的检 测大肠杆菌的方法。提出一种新的设计思路，即利用金磁粒原位氧化引发高灵敏化学发光来 进行大肠杆菌检测。目前，磁性纳米颗粒的制备方法以及功能化方面已有了深入系统的探索研究，可采用多 种技术途径制备磁性纳米颗粒和具有核-壳结构的功能化磁性纳米颗粒。工艺过程简单易行， 步骤简单；稳定性好，可以长期储存(半年以上)；形状和尺寸可以按需控制；在这些纳米 磁性颗粒上可有效修饰荧光基团、联结分子以及蛋白质(如抗体)和核酸等生物大分子，并 保持了被修饰生物分子的特异性，稳定性好，可长期保存。在此技术基础上，有望建立一种 超灵敏的化学发光检测体系，突破大肠杆菌的检测限。专利技术目的本专利技术的目的是为了提供一种超灵敏、速度快、低成本、容易实现自动化的检测大肠杆 菌的新方法，以便制备超灵敏且稳定性好的化学发光生物传感器，并且使其具有实验步骤简 单，操作简便等优点。
技术实现思路
本专利技术的目的通过下述方案来实现 金包覆磁性复合纳米粒子的制备，包括下述步骤1. 金包覆的磁性纳米颗粒(Fe304或Y-Fe203)的制备(a) 以共沉淀法制备Fe304。利用三价铁离子和二价铁离子的混合溶液，在碱(NaOH)的作用下，通过共沉淀法制得Fe304纳米粒子；然后，用氨基硅烷将所得的磁性粒子氨基化;再在金离子(Au3+)存在的条件下，利用超声化学法合成金包覆的Fe304纳米粒子。(b) 以Fe304纳米粒子为前驱，通过直接氧化法，在高温约40(TC条件下焙烧得到Y-Fe203 纳米粒子；随后，用氨基硅烷将？Fe203磁性粒子氨基化；再在金离子(Au3+)存在的条件下, 利用超声化学法合成金包覆的，Fe203纳米粒子。2. 金包覆磁粒表面生物功能化与抗原抗体结合形成免疫夹心结构(C)利用巯基乙胺使得金磁粒表面修饰上巯基，在其表面形成巯基键(一SH);然后， 在戊二醛的作用下，使得金磁粒表面修饰上醛基，因为醛基易于键合吸附单抗，如此即可形 成单抗化金磁粒。(d)将单抗化的金磁粒对大肠杆菌进行特异性吸附；然后，再进行第二抗体修饰，两者结合形成特殊的免疫夹心结构；加入强氧化剂(HCl-NaCl-Br2)体系后，使f导磁粒上的Au单 质被氧化为A^+离子，由于上述夹心结构呈强负电性，游离的Ai^+可被特异性吸附在其周围； 用鲁米诺处理后，可建立化学发光体系。 本专利技术相比现有技术具有如下优点(1) 金包覆的磁性纳米粒子(Fe304或Y-Fe203)的制备是基于超声条件下的化学合成 新路线；并通过生物功能化获得单抗化Au包覆磁粒，为发光体系同时提供金离子源与生物 识别捕获基础，避免了用胶体金标记第二抗体的繁琐。(2) 通过磁性纳米粒子的生物功能化修饰制备获得抗原抗体结合体系，并利用金包覆 的原位氧化引发化学发光效应，实现新型的大肠杆菌0157:H7化学发光生物传感器的制备与 大肠杆菌0157:H7的超灵敏检测。较之原来使用的检测生物分子的方法，经金包覆的磁粒特 异性吸附，产生化学发光后，操作更简洁，灵敏度更高，可望突破现在大肠杆菌0157:H7的 抗原检测限。附图说明图l金磁粒的制备，为实施方案I流程图。图2单抗化的金磁粒，为实施方案n流程图。图3结合第二抗体的金磁粒夹心结构，为实施方案ni流程图。具体实施方式 实施方案I :1 )分别取2 g FeClr4H20和5.2 g FeCl3-6H20以及12.1 mol/L的浓盐酸0.85mL溶解于 200mLH2O中，超声脱氧；然后将以上溶液滴加到250rnL， 0.75 tnol/L NaOH溶液中，所有 反应在温度为8(TC，搅拌，N2保护下进行。随着反应的进行，反应液中出现黑色的沉淀。反 应结束后，利用外加磁场将所得沉淀从反应介质中分离出来，可得到Fe304磁性纳米粒子。2) 然后滴加0.4mLAPTES到以上混合溶液中，室温下搅拌7h;进行磁分离，得到APTES修饰 的Fe304磁性纳米粒子。3)将15mL以上制备的溶液(lg/L, Fe3O4)、0.6mmol/LAua3'HCl'4H2O 水溶液14mL分散到100mL去离子水中，搅拌均匀；滴加0.2 mol/L柠檬酸纳溶液0.3mL， 在一定的频率下，室温下超声直到反应溶液颜色由浅黄色逐渐变成黑色。得到金包覆的Fe304 磁性纳米粒子。1)取上述制备好的Fe304磁性纳米粒子2g，放入马弗炉中，加热至40(TC，焙烧约2-3 小时，可制得Y-Fe203磁性纳米粒子。2)然后滴加0.4mLAPTES到以上混合溶液中，室温下 搅拌7h;进行磁分离，得到APTES修饰的，Fe203磁性纳米粒子。3)再将15mL以上制备 的溶液(lg/L， Fe304)、 0.6mmol/LAuCl3.HCl'4H20水溶液14mL分散到lOOmL去离子水中， 搅拌均匀；滴加0.2mol/L柠檬酸纳溶液0.3mL，在一定的频率下，室温下超声直到反应溶液 颜色由浅黄色逐渐变成黑色。得到金包覆的，Fe203磁性纳米粒子。实验方案II:1)取20mg上述已经制备好的金磁粒子，置于一试管中，加入20mg/mL的半胱胺溶液， 在室温条件下，通氩气保护，反应48h。 2)再将10mL 、 12%的戊二醛水溶液添加到上述混 合液中，在室温下，振荡均匀，孵化12小时后，修饰上醛基的金磁粒被磁分离，使用PB缓 冲液清洗3次。3)取100吗的醛基化的金磁粒加入到2.5mL、 10 %的第一抗体的磷酸盐缓冲 液(Phosphate Buffer, PB， pFK7.4)中，40 。C下孵化2小时，并将该溶液不断振荡混匀。 通过醛基与单抗分子中的胺基官能团反应将后者连接到颗粒表面。4)反应结束后，利用外加 磁场将颗粒从反应介质中分离出，并用PB溶液反复清洗产物，最后以4.0 mg/mL的浓度分 散在PB溶液中，得到单抗化的金磁粒，待用。实施方案m:1)取上述单抗化的金磁粒溶液25mL，置于一试管中，将其与10%的人工大肠杆菌菌液 充分混合，在4(TC温度下孵育2小时，进行本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种金包覆磁粒原位引发高灵敏化学发光检测大肠杆菌的新方法，包括下述步骤：　１．１金包覆的磁性纳米颗粒（Ｆｅ↓［３］Ｏ↓［４］或γ－Ｆｅ↓［２］Ｏ↓［３］）的制备：　（ａ）以共沉淀法制备Ｆｅ↓［３］Ｏ↓［４］。采用三价铁离子和二价 铁离子的混合溶液，在碱（ＮａＯＨ）的作用下，通过共沉淀法制得Ｆｅ↓［３］Ｏ↓［４］纳米粒子；随后在氨基硅烷的作用下，将所得磁性粒子氨基化；再在金离子（Ａｕ↑［３＋］）存在的条件下，利用超声化学法合成金包覆的Ｆｅ↓［３］Ｏ↓［４］纳米粒子。　　（ｂ）以Ｆｅ↓［３］Ｏ↓［４］纳米粒子为前驱，通过直接氧化法，在高温约４００℃条件下焙烧得到γ－Ｆｅ↓［２］Ｏ↓［３］纳米粒子；随后，在氨基硅烷的作用下，将γ－Ｆｅ↓［２］Ｏ↓［３］磁性粒子氨基化；再在金离子（Ａｕ↑［３＋］）存在的条 件下，利用超声化学法合成金包覆的γ－Ｆｅ↓［２］Ｏ↓［３］纳米粒子。　１．２金包覆磁粒表面生物功能化与抗原抗体结合形成免疫夹心结构：　（ｃ）利用巯基乙胺使得金磁粒（Ｆｅ↓［３］Ｏ↓［４］或γ－Ｆｅ↓［２］Ｏ↓［３］）表面修饰上巯 基，在其表面形成巯基键（－ＳＨ）；然后，在戊二醛的作用下，使得金磁粒表面修饰上醛基，利用醛基易于吸附键合单抗这一特性，形成单抗化金磁粒。　（ｄ）用单抗化金磁粒对大肠杆菌进行特异性吸附，得到第一抗体抗原与金磁粒复合物；随后，进行第二抗体 修饰，第二抗体与前述复合物结合形成特殊的免疫夹心结构；再加入强氧化剂（ＨＣｌ－ＮａＣｌ－Ｂｒ↓［２］）体系，将磁粒上的Ａｕ单质氧化为Ａｕ↑［３＋］离子吸附在大肠杆菌周围，用鲁米诺处理后，即可得到化学发光样品体系。...

【技术特征摘要】
1、一种金包覆磁粒原位引发高灵敏化学发光检测大肠杆菌的新方法，包括下述步骤1. 1 金包覆的磁性纳米颗粒(Fe3O4或γ-Fe2O3)的制备(a)以共沉淀法制备Fe3O4。采用三价铁离子和二价铁离子的混合溶液，在碱(NaOH)的作用下，通过共沉淀法制得Fe3O4纳米粒子；随后在氨基硅烷的作用下，将所得磁性粒子氨基化；再在金离子(Au3+)存在的条件下，利用超声化学法合成金包覆的Fe3O4纳米粒子。(b)以Fe3O4纳米粒子为前驱，通过直接氧化法，在高温约400℃条件下焙烧得到γ-Fe2O3纳米粒子；随后，在氨基硅烷的作用下，将γ-Fe2O3磁性粒子氨基化；再在金离子(Au3+)存在的条件下，利用超声化学法合成金包覆的γ-Fe2O3纳米粒子。1. 2 金包覆磁粒表面生物功能化与抗原抗体结合形成免疫夹心结构(c)利用巯基乙胺使得金磁粒(Fe3O4或γ-Fe2O3)表面修饰上巯基，在其表面形成巯基键(—SH)；然后，在戊二醛的作用下，使得金磁粒表面修饰上醛基，利用醛基易于吸...

【专利技术属性】
技术研发人员：贺全国，曾蕾，蒋佩，
申请(专利权)人：湖南工业大学，贺全国，曾蕾，蒋佩，
类型：发明
国别省市：43[中国|湖南]