海南粗榧种胚培养育苗方法技术

本发明专利技术海南粗榧种胚培养育苗方法，涉及一种植物的快速繁育方法。按照下述步骤进行：（１）外植体的采集与选择；（２）种子的洗净、灭菌与种胚获取；（３）种胚接种与培养；（４）试管苗继代与诱导生根；（５）驯化移栽。本发明专利技术首创了用海南粗榧种胚作外植体组培快繁的整套方法，并提供了海南粗榧种胚育苗的优良培养基，不仅可以生产整齐一致的优质海南粗榧幼苗，为解决珍稀濒危植物海南粗榧快繁和恢复保护与资源开发利用提供技术保障；也为进一步探索海南粗榧的基因工程、拓宽外植体材料等莫定了基础。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种植物的快速繁育方法，尤其涉及海南粗榧种子胚培养进快繁育苗方法。
技术介绍
海南粗榧(C印/za/otoo^/^'aew^yLi)为三尖杉科植物，别名红壳松、薄叶蓖子杉， 为多年生高大常绿乔木。是我国特有的珍稀树种，其分布范围极为狭窄，仅见于海南及广东、 云南等局部地区。研究表明，海南粗榧不仅有效生物碱含量为三尖杉科中最高，而且疗效最 显著，是目前公认的最好抗癌树种之一。再加之该树种因材质优良而屡遭砍伐，加之种群数 量少，是我国最重要的珍稀濒危植物之一。但该树种自然资源十分有限，很难满足日益增长 的需求。由于该树种为雌雄异株、种子产量和萌发率很低，受生态和人为破坏等因素而导致 瀕临灭绝。鉴于此，海南粗榧的物种保护引起植物学研究机构的高度重视。目前，海南粗榧 繁殖方式主要有两种。其一是种子繁殖。但该树种自然资源十分有限，而且为雌雄异株、种 子产量和萌发率很低(每年每雌株仅数十粒种子，种子萌发率野外约10% (—方面是因为海 南粗榧种子萌发需要低温解除休眠，海南难以满足；另一方面海南粗榧种子在野外很易被动 物啃食)、传统人工萌发约20%)，而且海南粗榧种子野外和传统的萌发方法需要约l年以上时 间才能成苗，再加之受其生态和人为破坏等因素而导致海南粗榧濒临灭绝(王献溥,王有生.海 南粗榧濒危的原因和保护措施.广西植物1994， 14 (4): 369-372)。其二是扦插繁殖。但是在 种质资源濒临灭绝的情况下，通过扦插提供大量苗木的难度很大，远远满足不了制药行业对 海南粗榧的需求，而且会对海南粗榧的有限资源造成更大的破坏；而且资料表明扦插幼嫩蓬 段来源直接影响到扦插幼苗的生长态势，只有来源于主茎顶端的幼嫩枝条扦插产生的幼苗能 正常直立良好生长；而主茎顶端幼嫩茎段取材会直接毁灭该株植物的正常生长。所以，扦插 繁殖基本不能推广(符文英,潘学峰,陈秀蕙,刘国民,李任珠.海南粗榧扦插与生根试验研究.海 南大学学报(自然科学版)，1997,15(3) :239-244;潘学峰,符文英，陈秀蕙,刘国民，李任珠.海南粗 榧扦插繁殖研究.热带农业科学，1996， (3): 25-30;杜道林,符文英.珍稀濒危植物海南粗榧 种群保护生物生态学.湖南科技出版社，2003.11)。另外也有人研究采用传统的组织培养方 法对海南粗榧进行幼苗繁殖，但是基本不能出苗，或者出苗率很低，不能进行应用推广(符 文英，杜道林，符木均.海南粗榧愈伤组织的诱导和培养.植物生理学通讯，2004， 40(1): 34-36; 李志英，王祝年,徐立.海南粗榧的离体快速繁殖.植物生理学通讯，2005， 41(5): 786)。本专利技术提供了一种直接以海南粗榧种子胚培养进行快繁育苗，在较短的时间内，仅用很 少数量的种子便可以生产大量整齐一致的优质种苗，避免不能获得大量种子的的限制问题和扦插与组培的技术问题，非常适宜大量推广，以满足海南粗榧这一珍稀濒危植物种苗迫切需 求。
技术实现思路
本专利技术解决的关键技术问题是直接以海南粗榧种子胚为外植体进行培养，产生有根的试 管苗，去根，诱导产生丛生芽，再诱导生根，形成幼苗。从而生产整齐一致的优质海南粗榧 幼苗，为解决珍稀濒危植物海南粗榧快繁和恢复保护与资源开发利用提供技术保障。本专利技术要解决的技术问题是用海南粗榧种胚为外植体，提供整套海南粗榧种苗快繁方法。 解决上述问题的技术方案包括如下步骤(1) 外植体的采集与选择采集并选择发育成熟的种子；(2) 种子的洗净、灭菌与种胚获取将成熟种子冲水1-3 h.，并用蒸馏水清洗干净，滤 纸吸干后放入约0.5-2.0%次氯酸钠溶液中真空抽滤灭菌3-8 miri ，然后无菌水反复冲洗3-6 次；在无菌操作台上，利用已灭菌解剖显微镜用剪刀及小镊子剥去种壳并用刀尖挑取种胚； 或者将灭菌好的种子直接转入以下第(3)步；(3) 种胚接种与培养将获得的海南粗榧种胚或者灭菌好的种子接种到如下培养基上培 养0.5-1 MS(Murashige and Skoog Stock培养基)+ 0.01-0.1 mg.L-1 6-BA (6-节基嘌呤)+ 0-100 mg'L肌醇+0.2-0.6%琼月旨+ 1-5%蔗糖+ 1-5%椰子乳，pH值5.0-6.0;暗培养2d后 再置于光照周期161rcT1、光照强度2000-3000 Lux的冷光灯下、环境温度25 士 2 °C中继 续培养15-25 d,便获得新绿色的生有根的试管苗；(4) 试管苗继代与诱导生根将该生根的试管苗去根后在以下培养基上进行继代培养 0.5-1 MS + 0.1-2.0 mg.L管1 6-BA + 0.01-0.2 mg-I/1 NAA (萘乙酸)+ 0-100 mg-L肌醇+ 0.2-0.6%琼脂+1-5°/。蔗糖+0.1-0.5%活性炭，pH值5.0-6.0;每3-5周继代一次，经2-4次 继代，即可转入以下培养基上诱导植株生根0.5-1 MS + 5.0-10.0 mg'LIBA (3-吲哚丁酸)+ 0-100 mg'L肌醇+0.2-0.6%琼月旨+1-5%蔗糖,？11值5.0-6.0。(5) 驯化移栽将生根良好的幼苗移至驯化室、光照强度2 0000 Lux 、驯化l-2周， 将苗从试管取出，用温水冲洗苗根部培养基，再用冷水冲洗，移栽至体积比大约为椰糠:河沙 =1-3:1或蛙石:珍珠岩:泥炭=1-3:1-3:1混合而成的盆装人工基质中，每盆苗套上透明塑料袋， 隔3天将袋子剪一小口， 9-12 d去盆苗透明塑料袋移至温室培养；1-2周后分别移入花盆 或装袋制成袋苗(基质为从野外海南粗榧群落收集的土壤及地表腐殖质椰糠约按l-3: l比 例混合而成)，再培养l-2周，即可转入室外大棚培养生长；成活率达90%以上。本专利技术的有益效果是首创了用海南粗榧种胚作外植体组培快繁的整套方法，并提供了海南粗榧种胚育苗的优良培养基，不仅可以生产整齐一致的优质海南粗榧幼苗，为解决珍稀 濒危植物海南粗榧快繁和恢复保护与资源开发利用提供技术保障；也为进一步探索海南粗榧 的基因工程、拓宽外植体材料等莫定了基础。 具体实施例方式本专利技术具体实施方式下面结合实例予以阐明培养基中所需各种药品试剂均可市售获得， 按商品说明书所示常规方法配用，为行业所通用。 实施例1:(1) 外植体的采集与选择采集并选择发育成熟的种子；(2) 种子的洗净、灭菌与种胚获得将成熟种子冲水lh.，并用蒸馏水清洗干净，滤纸 吸干后放入0.5%次氯酸钠溶液中真空抽滤灭菌8!!1111 ,然后无菌水反复冲洗3次；(3) 种胚接种与培养在无菌操作台上，利用已灭菌解剖显微镜用剪刀及小镊子剥去种壳并用刀尖挑取种胚接种到如下培养基上培养:0.5 MS(Murashige and Skoog Stock培养基)+ 0.01 mg.L 6-BA (6-节基嘌呤)+ 0.2%琼脂+ 1%蔗糖+ 1°/。椰子乳，pH值5.0;暗培养2 d 后再置于光照周期16 lv(T1、光照强度2000 Lux的冷光灯下、环境温度25 士 2 'C中继续 培养15 d,便获得新绿色的生有根的试管苗；(4) 试管苗继代与诱导生根将该生根的试管苗去根后在以下培养基上进行继代培养 0.5 MS + 0.1 mg-本文档来自技高网...

【技术保护点】
海南粗榧种胚培养育苗方法，其特征在于按照下述步骤进行：　（１）外植体的采集与选择：采集并选择发育成熟的种子；　（２）种子的洗净、灭菌与种胚获取：将成熟种子冲水１－３ｈ．，并用蒸馏水清洗干净，滤纸吸干后放入０．５－２．０％次氯酸钠 溶液中真空抽滤灭菌３－８ｍｉｎ，然后无菌水反复冲洗３－６次；在无菌操作台上，利用已灭菌解剖显微镜用剪刀及小镊子剥去种壳并用刀尖挑取种胚；或者将灭菌好的种子直接转入以下第（３）步；　（３）种胚接种与培养：将获得的海南粗榧种胚或者灭菌好的 种子接种到如下培养基上培养：０．５－１Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ　ａｎｄ　Ｓｋｏｏｇ　Ｓｔｏｃｋ培养基＋０．０１－０．１ｍｇ.Ｌ－１　６－苄基嘌呤＋０－１００ｍｇ.Ｌ↑［－１］肌醇＋０．２－０．６％琼脂＋１－５％蔗糖＋１－５％椰子乳，ｐＨ值５．０－６．０；暗培养２ｄ后再置于光照周期１６ｈ.ｄ↑［－１］、光照强度２０００－３０００Ｌｕｘ的冷光灯下、环境温度２５±２℃中继续培养１５－２５ｄ，即可获得新绿色的生有根的试管苗；　（４）试管苗继代与诱导生根：将该生根的试管苗去根后在以下培 养基上进行继代培养：０．５－１Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ　ａｎｄ　Ｓｋｏｏｇ　Ｓｔｏｃｋ培养基＋０．１－２．０ｍｇ.Ｌ－１　６－苄基嘌呤＋０．０１－０．２ｍｇ.Ｌ↑［－１］萘乙酸＋０－１００ｍｇ－Ｌ↑［－１］肌醇＋０．２－０．６％琼脂＋１－５％蔗糖＋０．１－０．５％活性炭，ｐＨ值５．０－６．０；每３－５周继代一次，经２－４次继代，即可转入以下培养基上诱导植株生根：０．５－１Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ　ａｎｄ　ＳｋｏｏｇＳｔｏｃｋ培养基＋５．０－１０．０ｍｇ.Ｌ↑［－１］　３－吲哚丁酸＋０－１００ｍｇ.Ｌ↑［－１］肌醇＋０．２－０．６％琼脂＋１－５％蔗糖，ｐＨ值５．０－６．０；　（５）驯化移栽：将生根良好的幼苗移至驯化室、光照强度２００００Ｌｕｘ、驯化１－２周，将苗从试管取出，用温水冲洗苗根部培养基，再用冷水冲洗，移栽至以 体积比计为椰糠∶河沙＝１－３∶１或蛙石∶珍珠岩∶泥炭＝１－３∶１－３∶１混合而成的盆装人工基质中，每盆苗套上透明塑料袋，隔３天将袋子剪一小口，９－１２天去盆苗透明塑料袋移至温室培养；１－２周后分别移入花盆或装袋制成袋苗，其基质为从野外海南粗榧群落收集的土壤及地表腐殖质∶椰糠按１－３∶１体积比例混合而成，再培养１－２周，即可转入室外大棚培养生长。...

【技术特征摘要】
1、海南粗榧种胚培养育苗方法，其特征在于按照下述步骤进行(1)外植体的采集与选择采集并选择发育成熟的种子；(2)种子的洗净、灭菌与种胚获取将成熟种子冲水1-3h.，并用蒸馏水清洗干净，滤纸吸干后放入0.5-2.0％次氯酸钠溶液中真空抽滤灭菌3-8min，然后无菌水反复冲洗3-6次；在无菌操作台上，利用已灭菌解剖显微镜用剪刀及小镊子剥去种壳并用刀尖挑取种胚；或者将灭菌好的种子直接转入以下第(3)步；(3)种胚接种与培养将获得的海南粗榧种胚或者灭菌好的种子接种到如下培养基上培养0.5-1Murashige and Skoog Stock培养基+0.01-0.1mg·L-1 6-苄基嘌呤+0-100mg·L-1肌醇+0.2-0.6％琼脂+1-5％蔗糖+1-5％椰子乳，pH值5.0-6.0；暗培养2d后再置于光照周期16h·d-1、光照强度2000-3000Lux的冷光灯下、环境温度25±2℃中继续培养15-25d，即可获得新绿色的生有根的试管苗；(4)试管苗继代与诱导生根将该生根的试管苗去根后在以下培养基上进行继代培养0.5-1Murashige and Sk...

【专利技术属性】
技术研发人员：杜道林，祁珊珊，司春灿，宋经元，甘炳春，王有生，魏建和，
申请(专利权)人：江苏大学，
类型：发明
国别省市：32[中国|江苏]