【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于光生物手性催化合成领域，更具体地，涉及一种人工光酶及其制备和在光生物催化手性合成中的应用。
技术介绍
1、光催化合成作为一种高效、绿色的合成方法近年来发展迅速，已经被广泛用于氧化、还原、自由基原子转移、环加成等不同类型的有机反应，是当前有机合成化学的重要分支。例如，烯烃[2+2]环加成是被重点研究的光催化不对称合成反应，该反应是制备环丁烷分子结构的最高效直接的途径，而环丁烷是许多手性药物合成的重要中间体，但由于反应过程中间体的活性较高，小分子手性催化剂往往很难控制其立体选择性，而蛋白大分子的三维手性环境有望提供有效的手段来解决这一问题，因此不对称光生物催化越来越受到研究者们的关注。
2、不对称光生物催化作为有机化学和化学生物学交叉的前沿领域，其集合了光化学反应和生物酶各自的优势，是有机反应理想的驱动力。然而，自然界存在的光敏酶种类稀少、催化性能专一性较强且难以满足非天然有机反应的需求。因此，发展具有非天然活性中心的人工光敏酶对于拓展光生物催化的反应类型和应用范围具有重要的研究意义。近来，green教授和我们课题组已报道了利用基因密码子拓展技术将具有优异光催化性能的二苯甲酮非天然氨基酸(bpa)引入至天然蛋白骨架中构建人工光敏酶的研究(a.p.green etal，nature，2022，611，709-714；y.wu et al，nature，2022，611，715-720)，展示了该基因编码的人工光酶可以结合定向进化技术进一步优化其空腔微环境，进而提供与底物的氢键及多重弱键相互作用，实现非天然手性
技术实现思路
1、针对现有技术的不足或改进需求，本专利技术的主要目的在于提供一种人工光酶cmp在光生物催化手性合成中的应用，利用蛋白质定点化学修饰技术将有机光敏剂插入至天然蛋白骨架中构建得到人工光酶cmp，再利用cmp作为光酶催化剂在可见光作为反应驱动力下，催化2-官能化烯基吲哚衍生物发生[2+2]不对称光环加成反应生成手性环丁烷稠合的四环吲哚螺环类化合物。通过本专利技术所提供的蛋白质定点修饰技术可以发展多样性的人工光酶，其中本文构建的cmp人工光酶，可以在可见光为驱动力下通过能量转移途径实现高效的手性光催化，具有绿色环保、条件温和、高反应活性等特点。
2、根据本专利技术第一方面，提供了一种人工光酶的制备方法，在含有手性空腔的蛋白骨架内通过定点突变技术引入含有巯基官能团的半胱氨酸，然后，使碘代的光敏剂小分子与所述半胱氨酸发生亲核加成反应，即得到所述人工光酶。
3、优选地，所述光敏剂小分子为碘代乙酰胺化的光敏剂。
4、优选地，所述碘代乙酰胺化的光敏剂为碘代乙酰胺化的噻吨酮、碘代乙酰胺化的二苯甲酮、碘代乙酰胺化的占吨酮或碘代乙酰胺化的9-芴酮。
5、优选地，所述蛋白骨架为乳球多药耐药调节因子lmrr蛋白。
6、优选地，引入含有巯基官能团的半胱氨酸后，还包括将所述乳球多药耐药调节因子lmrr蛋白的空腔结构进行优化；优化后的乳球多药耐药调节因子lmrr蛋白的氨基酸序列为seq id no:1、seq id no:2、seq id no:3或seq id no:4所示。
7、根据本专利技术另一方面，提供了任意一项方法制备得到的人工光酶。
8、根据本专利技术另一方面，提供了所述的人工光酶作为光敏催化剂在光生物催化手性合成中的应用。
9、优选地，所述应用具体为：在光照条件下，所述人工光酶催化2-官能化烯基吲哚衍生物发生[2+2]不对称光环加成反应，得到手性环丁烷稠合的四环吲哚螺环类化合物；
10、反应式如下：
11、
12、其中：r1为5-h,5-f,5-ch3,5-br,5-cl,5-och3,4-och3,6-br或6-cl；
13、r2为-ch3或-苄基。
14、优选地，所述反应的溶剂为蛋白缓冲液和有机溶剂的混合溶液，其中有机溶剂的体积为所述混合溶液的体积的5～10％；所述反应的底物2-官能化烯基吲哚衍生物的初始浓度为0.1～0.5mm，所述人工光酶的添加浓度是2.5～5mol％；
15、优选地，所述有机溶剂为二甲基亚砜。
16、优选地，所述反应的温度4～6℃；所述光照的波长范围400～415nm。
17、总体而言，通过本专利技术所构思的以上技术方案与现有技术相比，主要具备以下的技术优点：
18、(1)本专利技术蛋白质定点化学修饰方法则可将含不同基团的有机分子引入至蛋白骨架中的特定位置，这一技术可以解决基因密码子拓展法难以构建含多种光敏中心的人工酶的难题。但目前基于蛋白质定点化学修饰法构建人工光酶用于光生物手性催化的研究仍没有报道，这主要是因为传统蛋白质定点化学修饰法难以结合高通量筛选过程进行人工酶的构校优化，因此实现光生物手性催化应用具有较大的挑战。本专利技术所提供的蛋白质定点修饰技术可以发展多样性的人工光酶，其中构建的cmp人工光酶，可以在可见光为驱动力下通过能量转移途径实现高效的手性光催化，具有绿色环保、条件温和、高反应活性等特点。
19、(2)本专利技术结果显示，将合成化学发展的优异光敏催化剂及光催化机制，通过蛋白质定点化学修饰法引入到天然蛋白酶中，可以从根本上拓展光酶的种类，从而拓宽光生物催化反应的类型。发展的人工光酶不仅具有有机小分子光敏剂高反应活性的特点，还兼具了生物大分子高选择性的反应特性。此外，蛋白质定点化学修饰技术可以引入多种结构、性质各异的光敏剂分子，因此通过此技术构建的人工光酶可以适应不同化学特性，不同反应需求的底物，是不对称光化学合成的通用解决方案。
20、(3)本专利技术优选地，本专利技术是首次使用蛋白质定点化学修饰技术将有机光敏中心碘代乙酰胺化的噻吨酮3c引入至天然蛋白骨架中构建得到人工光酶，是首次以人工光酶cmp实现光生物手性催化。以2-官能化烯基吲哚衍生物的[2+2]不对称光环加成反应为例，光催化[2+2]光环加成反应是构建含环丁烷结构分子最直接方便的方法，但是由于反应过程中间体的活性较高，小分子手性催化剂往往很难控制其立体选择性，而本专利技术中将有机化学发展的有机小分子光催化剂引入至天然蛋白骨架中由此得到cmp人工光酶，可以利用蛋白骨架二级配位层的作用，提供与底物之间的多重氢键及弱相互作用，从而实现[2+2]不对称光环加成反应。本专利技术构建的人工光酶对12个底物反应均能够得到大于90％的产率，81～92％的e.e.值，具有较高的立体选择性。
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1.一种人工光酶的制备方法，其特征在于，在含有手性空腔的蛋白骨架内通过定点突变技术引入含有巯基官能团的半胱氨酸，然后，使碘代的光敏剂小分子与所述半胱氨酸发生亲核加成反应，即得到所述人工光酶。
2.如权利要求1所述的人工光酶的制备方法，其特征在于，所述碘代的光敏剂小分子为碘代乙酰胺化的光敏剂。
3.如权利要求2所述的人工光酶的制备方法，其特征在于，所述碘代乙酰胺化的光敏剂为碘代乙酰胺化的噻吨酮、碘代乙酰胺化的二苯甲酮、碘代乙酰胺化的占吨酮或碘代乙酰胺化的9-芴酮。
4.如权利要求1所述的人工光酶的制备方法，其特征在于，所述蛋白骨架为乳球多药耐药调节因子LmrR蛋白。
5.如权利要求4所述的人工光酶的制备方法，其特征在于，引入含有巯基官能团的半胱氨酸后，还包括将所述乳球多药耐药调节因子LmrR蛋白的空腔结构进行优化；优化后的乳球多药耐药调节因子LmrR蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4所示。
6.如权利要求1-5任意一项方法制备得到的人工光酶。p>
7.如权利要求6所述的人工光酶作为光敏催化剂在光生物催化手性合成中的应用。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述应用具体为：在光照条件下，所述人工光酶催化2-官能化烯基吲哚衍生物发生[2+2]不对称光环加成反应，得到手性环丁烷稠合的四环吲哚螺环类化合物；
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述反应的溶剂为蛋白缓冲液和有机溶剂的混合溶液，其中有机溶剂的体积为所述混合溶液的体积的5～10％；所述反应的底物2-官能化烯基吲哚衍生物的初始浓度为0.1～0.5mM，所述人工光酶的添加浓度是2.5～5mol％；
10.如权利要求8或9所述的应用，其特征在于，所述反应的温度4～6℃；所述光照的波长范围400～415nm。
...【技术特征摘要】
1.一种人工光酶的制备方法，其特征在于，在含有手性空腔的蛋白骨架内通过定点突变技术引入含有巯基官能团的半胱氨酸，然后，使碘代的光敏剂小分子与所述半胱氨酸发生亲核加成反应，即得到所述人工光酶。
2.如权利要求1所述的人工光酶的制备方法，其特征在于，所述碘代的光敏剂小分子为碘代乙酰胺化的光敏剂。
3.如权利要求2所述的人工光酶的制备方法，其特征在于，所述碘代乙酰胺化的光敏剂为碘代乙酰胺化的噻吨酮、碘代乙酰胺化的二苯甲酮、碘代乙酰胺化的占吨酮或碘代乙酰胺化的9-芴酮。
4.如权利要求1所述的人工光酶的制备方法，其特征在于，所述蛋白骨架为乳球多药耐药调节因子lmrr蛋白。
5.如权利要求4所述的人工光酶的制备方法，其特征在于，引入含有巯基官能团的半胱氨酸后，还包括将所述乳球多药耐药调节因子lmrr蛋白的空腔结构进行优化；优化后的乳球多药耐药调节因子lmrr蛋白的氨基酸序列为seq i...
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