【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物医药，具体涉及一种人源肺纤维化类器官模型的构建方法及其应用。
技术介绍
1、特发性肺纤维化(ipf)是一种病因不明确、慢性、进行性、纤维化性的肺间质性疾病。近一半患者在确诊后2-3年内死亡，5年生存率低于30％，比大多数癌症的生存率都低，所以ipf又常被称作“不是癌症的癌症”。目前，ipf的诊疗仍面临许多难题，只有两款治疗药物上市——吡非尼酮和尼达尼布，而这些药物只能延缓肺功能下降及ipf进程，尚无法恢复已经受损的肺部组织和肺功能，且长期使用可能带来严重的副作用。因此，需要开发新的药物和治疗策略，以改善ipf患者的生存率和生活质量。为了解决上述问题，建立能够模拟ipf自然病程的模型对于研究其发病机制、筛选药物和治疗策略具有重要意义。
2、近年来，随着类器官(organoids)技术的不断发展，利用3d类器官模型模拟肺纤维化疾病的应用逐渐增多。现有的肺纤维化类器官模型主要采用博来霉素(blm)或tgfβ1刺激肺类器官或与成纤维细胞共培养的肺类器官而构建。博来霉素(blm)是一种常用的诱导剂，它能够诱导dna断裂，产生自由基，引发炎症反应和纤维化。然而，blm的剂量和溶液体积与纤维化的发生有着密切的关系，而且不同个体对blm的敏感程度存在较大差异，还会经常出现自限性，这使得blm诱导肺纤维化模型的成功率极不稳定。另一方面，tgfβ1作为一种纤维化的下游信号分子，常被直接用于触发成纤维细胞的纤维化表型。然而，这种方法忽略了许多中间过程中发生的重要分子事件，例如肺上皮细胞的受损老化与抗炎/促炎调控等；并且t
3、ipf特点是肺间质和肺泡腔内纤维化，形成永久疤痕，导致肺泡结构改变和肺功能持续下降。2型肺泡上皮细胞(aec ii)和成纤维细胞的相互作用在肺纤维化中起到了重要的作用。当aec ii受到损伤或刺激时，促进多种促纤维化因子分泌，如tgf-β、血小板源性生长因子(pdgf)、结缔组织生长因子(ctgf)、tnf-α等，从而激活成纤维细胞并促进其迁移、增殖、激活和分化为肌成纤维细胞。这些肌成纤维细胞促进细胞外基质大量合成及过度沉积导致肺纤维化的发生。因此，如果存在一种不依赖于外界刺激因子，而是直接由成纤维细胞与aec ii细胞间相互作用形成的肺纤维化类器官模型，则有望在体外真实地模拟肺纤维化发生发展过程，为研究纤维化发病机制、筛选药物和治疗等提供一个可靠的人源评价工具。
技术实现思路
1、为了克服现有技术中的缺陷，本专利技术提供了一种人源肺纤维化类器官模型的构建方法，首次使用人肺组织成体干细胞aec ii细胞与病理性成纤维细胞体外共培养21～28天构建肺纤维化类器官模型，更好地模拟了aec ii细胞和病理性成纤维细胞在长期病理状态下的相互作用。这种方法不仅可以模拟ipf的自然病程，还可以用于研究肺纤维化疾病的发病机制和筛选治疗策略。
2、为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：
3、本专利技术的第一方面是提供一种人源肺纤维化类器官模型的构建方法，将人源aecii细胞和特发性肺纤维化患者来源的肺成纤维细胞体外3d共培养获得人源肺纤维化类器官模型。
4、进一步地，人源aec ii细胞和特发性肺纤维化患者来源的肺成纤维细胞按照一定的细胞比例种胶滴；等胶滴凝固后，加入肺泡类器官培养基培养一定时间后获得人源肺纤维化类器官模型。
5、进一步地，上述人源aec ii细胞分离自肺组织；优选采用如下步骤获得：将肺组织剪切成小碎块，然后进行消化、过滤、冲洗和离心，收集细胞沉淀，红细胞裂解完成后分选获得aec ii细胞；更优选地，获得aec ii细胞后，进行3d培养，获得肺泡类器官，消化后再次分选获得aec ii细胞，以获得更多的aec ii细胞。
6、进一步地，肺组织消化采用的消化液包括ⅰ型胶原酶、dna酶i、分散酶和pbs缓冲液，消化的条件为：在37±0.5℃条件下摇晃消化，时间为30～45min。
7、进一步地，肺泡类器官消化采用的是分散酶和tryple express；优选先用分散酶消化5～15min，离心取沉淀后，再用tryple express消化3～5min至单个细胞悬液。
8、进一步地，上述3d培养为：以102～103个aec ii细胞/1μl基质胶的比例种胶滴，在37±0.5℃条件下孵育20～40min，等胶滴凝固后，加入肺泡类器官培养基培养14～21天，构建肺泡类器官。
9、进一步地，上述基质胶为matrigel和advanceddmem/f12的混合液；优选地，在该基质胶中，matrigel和dmem/f12的体积比为1：1。
10、进一步地，上述肺泡类器官培养基包括如下成分：advanced dmem/f12基础培养基，1×b27，1×抗生素-抗真菌，1×glutamax，15mm hepes，1.25mm n-乙酰-l-半胱氨酸，3μm chir99021，10μma83-01，1μm birb796，10ng/ml human fgf10和50ng/ml human egf。
11、进一步地，上述特发性肺纤维化患者来源的肺成纤维细胞通过以下方法获取：将特发性肺纤维化患者来源的肺组织剪切成小块，均匀平铺在培养皿中，用成纤维细胞培养基至贴壁细胞存在，弃去组织继续培养7～14天。
12、进一步地，人源aec ii细胞和特发性肺纤维化患者来源的肺成纤维细胞的数量比例为1:2～4，优选为1:1。
13、进一步地，将人源aec ii细胞和特发性肺纤维化患者来源的肺成纤维细胞分别以102～103个细胞/1μl基质胶的比例重悬，然后细胞悬液按照1:1的体积比种胶滴，在37±0.5℃条件下孵育20～40min，等胶滴凝固后，加入肺泡类器官培养基培养20～30天，构建肺纤维化类器官模型。
14、本专利技术的第二方面是提供上述构建方法在研发和筛选治疗肺纤维化疾病的药物中的应用。
15、进一步地，在共培养的肺泡类器官培养基中加入不同的药物，观察肺纤维化类器官模型的变化。
16、本专利技术采用以上技术方案，与现有技术相比，具有如下技术效果：
17、1.模拟肺纤维化病理过程：构建的模型能够模拟肺纤维化的病理过程，包括成纤维细胞与aec ii细胞的相互作用、细胞外基质的合成和沉积等，有助于探讨肺纤维化的发病机制。
18、2.筛选药物和治疗策略：构建的模型可以评估不同药物对肺纤维化疾病的治疗效果，为新药研发提供筛选平台。
19、3.降低实验成本：该构建方法简单，且使用类器官模型可以降低实验成本，避本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种人源肺纤维化类器官模型的构建方法，其特征在于，将人源AEC II细胞和特发性肺纤维化患者来源的肺成纤维细胞体外3D共培养获得人源肺纤维化类器官模型。
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，人源AEC II细胞和特发性肺纤维化患者来源的肺成纤维细胞按照一定的细胞比例种胶滴；等胶滴凝固后，加入肺泡类器官培养基培养一定时间后获得人源肺纤维化类器官模型。
3.根据权利要求1或2所述的构建方法，其特征在于，所述人源AEC II细胞分离自肺组织；优选采用如下步骤获得：将肺组织剪切成小碎块，然后进行消化、过滤、冲洗和离心，收集细胞沉淀，红细胞裂解完成后分选获得AEC II细胞；更优选地，获得AEC II细胞后，进行3D培养，获得肺泡类器官，消化后再次分选获得AEC II细胞，以获得更多的AEC II细胞。
4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，肺组织消化采用的消化液包括Ⅰ型胶原酶、DNA酶I、分散酶和PBS缓冲液，消化的条件为：在37±0.5℃条件下摇晃消化，时间为30～45min。
5.根据权利要求3所述的构建方法，其特
6.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，所述3D培养为：以102～103个AEC II细胞/1μl基质胶的比例种胶滴，在37±0.5℃条件下孵育20～40min，等胶滴凝固后，加入肺泡类器官培养基培养14～21天，构建肺泡类器官。
7.根据权利要求6所述的构建方法，其特征在于，所述基质胶为Matrigel和AdvancedDMEM/F12的混合液；优选地，在所述基质胶中，Matrigel和DMEM/F12的体积比为1：1。
8.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述肺泡类器官培养基包括如下成分：Advanced DMEM/F12基础培养基，1×B27，1×抗生素-抗真菌，1×Glutamax，15mMHEPES，1.25mM N-乙酰-L-半胱氨酸，3μM CHIR99021，10μMA83-01，1μM BIRB796，10ng/mlhuman FGF10和50ng/ml human EGF。
9.根据权利要求1或2所述的构建方法，其特征在于，所述特发性肺纤维化患者来源的肺成纤维细胞通过以下方法获取：将特发性肺纤维化患者来源的肺组织剪切成小块，均匀平铺在培养皿中，用成纤维细胞培养基至贴壁细胞存在，弃去组织继续培养7～14天。
10.根据权利要求1或2所述的构建方法，其特征在于，所述人源AEC II细胞和特发性肺纤维化患者来源的肺成纤维细胞的数量比例为1:2～4，优选为1:1。
11.根据权利要求10所述的构建方法，其特征在于，将人源AEC II细胞和特发性肺纤维化患者来源的肺成纤维细胞分别以102～103个细胞/1μl基质胶的比例重悬，然后细胞悬液按照1:1的体积比种胶滴，在37±0.5℃条件下孵育20～40min，等胶滴凝固后，加入肺泡类器官培养基培养20～30天，构建肺纤维化类器官模型。
12.如权利要求1-11任一项所述构建方法在研发和筛选治疗肺纤维化疾病的药物中的应用。
13.根据权利要求12所述的应用，其特征在于，在共培养的肺泡类器官培养基中加入不同的药物，观察肺纤维化类器官模型的变化。
...【技术特征摘要】
1.一种人源肺纤维化类器官模型的构建方法，其特征在于，将人源aec ii细胞和特发性肺纤维化患者来源的肺成纤维细胞体外3d共培养获得人源肺纤维化类器官模型。
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，人源aec ii细胞和特发性肺纤维化患者来源的肺成纤维细胞按照一定的细胞比例种胶滴；等胶滴凝固后，加入肺泡类器官培养基培养一定时间后获得人源肺纤维化类器官模型。
3.根据权利要求1或2所述的构建方法，其特征在于，所述人源aec ii细胞分离自肺组织；优选采用如下步骤获得：将肺组织剪切成小碎块，然后进行消化、过滤、冲洗和离心，收集细胞沉淀，红细胞裂解完成后分选获得aec ii细胞；更优选地，获得aec ii细胞后，进行3d培养，获得肺泡类器官，消化后再次分选获得aec ii细胞，以获得更多的aec ii细胞。
4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，肺组织消化采用的消化液包括ⅰ型胶原酶、dna酶i、分散酶和pbs缓冲液，消化的条件为：在37±0.5℃条件下摇晃消化，时间为30～45min。
5.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，肺泡类器官消化采用的是分散酶和tryple express；优选先用分散酶消化5～15min，离心取沉淀后，再用tryple express消化3～5min至单个细胞悬液。
6.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，所述3d培养为：以102～103个aec ii细胞/1μl基质胶的比例种胶滴，在37±0.5℃条件下孵育20～40min，等胶滴凝固后，加入肺泡类器官培养基培养14～21天，构建肺泡类器官。
7.根据权利要求6所述的构建方法，其特征在于，所述基质胶为matrig...
【专利技术属性】
技术研发人员：姚懿雯，李冬，孙祖俊，田佳乐，吴军录，
申请(专利权)人：上海市同济医院，
类型：发明
国别省市：
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