【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物，尤其涉及一种用于大片段载体构建的感受态细胞的制备及转化方法。
技术介绍
1、感受态细胞是通过理化方法诱导细胞，使其处于最适摄取和容纳外来dna的生理状态，能够吸收周围环境中的dna的细胞。感受态细胞制备及转化是其中一项重要的操作技术，多个大片段融合转化效率高低是决定着重组dna能否顺利进入受体细胞，完成组装表达出新的遗传性状，是代谢调控与碱基编辑等生物技术成功与否的关键环节之一。目前随着基因工程研究引入农作物和微生物基因组编辑与调控的研究阶段，传统氯化钙法、hanahan法和inoue法制备感受态细胞及缺陷型xl10菌株制得的感受态细胞转化效率最高达到107-109cfu/ug质粒dna，适宜一般试验需求，且操作复杂、可重复性差，目前报道的电转化是小家最高的感受态制备及转化方法，可达1010cfu/ug dna，且适用于大多数细菌转化。
2、用于建立大片段基因组文库或动物、植物、微生物基因组编辑载体构建，其特点是质粒较大(一般融合后达几万bp)、多片段难融合、不稳定等，则需要采用转化效率高的转化方法，并能使多片段融合时不产生片段丢失、序列准确、重复性好的高保守菌株作为宿主细胞。
3、c3040(stable competent e.coli/high efficiency)适于高效转化和分离含有重复元件的质粒克隆的化学活性大肠杆菌细胞，将其基因组敲除了重组酶和核酸酶，基因型为f′proa+b+laciqδ(lacz)m15 zzf::tn10(tetr)/δ(ara-leu)7697a
4、高效转化的感受态还受宿主细胞培养环境及转化后处理方式影响。为了克服以上存在的一些技术瓶颈，本专利技术开发了一种以大肠杆菌c3040菌株为宿主制备高保守电转感受态细胞，并对转化效率更高、稳定性更强的电转化方法进行参数条件探索及优化，获得可用于多片段大片段融合的高保守电转化感受态细胞及高效电转化方法，比商业感受态细胞转化效率高，在实验室可以长期保存扩繁，随用随制，大大降低成本，并保证感受态细胞能长期供应。
技术实现思路
1、本专利技术所要解决的技术问题是克服现有技术中存在的不足，提供一种用于大片段载体构建的高保守电转感受态细胞制备及转化方法。
2、本专利技术是通过以下技术方案予以实现：
3、一种用于大片段载体构建的感受态细胞的制备方法，包括如下步骤：
4、s1.将低温保存的大肠杆菌c3040菌株，在常温下过夜培养，获得过夜培养菌；
5、s2.将所述过夜培养菌转移至摇瓶中，常温下培养2-6h后冷却保存；
6、s3.将步骤s2中冷却后的细胞分装在离心管中，低温下离心，弃上清液；
7、s4.用灭菌的冰水重悬浮s3获得的细胞，并将其置于离心管中，低温下离心，弃上清液；
8、s5.重复步骤s3、s4，并将获得的细胞用20ml灭菌预冷的10％甘油重悬浮，后低温下离心，弃上清液；
9、s6.用预冷的10％甘油重悬浮步骤s5离心后获得的沉淀细胞至终体积为1-2ml，后等量分装离心管中，液氮速冻后保存，即为c3040感受态细胞。
10、根据上述技术方案，优选地，步骤s1包括：将低温保存的大肠杆菌c3040菌株置于soc培养基平板划线活化，37℃下过夜培养；挑取培养板上一个单菌落接种于液体lb培养基，37℃下过夜培养12h以上，获得过夜培养菌。
11、根据上述技术方案，优选地，步骤s2包括：转移0.5ml所述过夜培养菌至液体soc培养基的摇瓶中，37℃、200rpm培养2-6h；定时检测所述液体lb培养基中培养液的od600值处于0.5-0.6时，取出摇瓶，置于冰上冷却至少15min。
12、根据上述技术方案，优选地，步骤s3、s4中，离心条件为：在4℃、3900-4000rpm下离心15min。
13、根据上述技术方案，优选地，步骤s4中所述灭菌的冰水由双蒸水经过高压灭菌60min，取出冷却至常温，再放置冰箱中冷却至5℃以下。
14、根据上述技术方案，优选地，步骤s5、s6中，所述10％甘油采用纯甘油与双蒸水体积比1:9混匀，再高压灭菌15min。
15、本专利还公开了一种用于大片段载体构建的感受态细胞的转化方法，包括以下步骤：
16、s11.将所述c3040感受态细胞在冰上解冻，并与连接产物dna在离心管中混匀后放置冰上，获得dna/细胞混合物；
17、s22.将所述dna/细胞混合物转移至冷却后的电穿孔容器中，放置在电转化仪中在电压1.7kv、电击时长5ms的条件下电击；
18、s33.加入山梨醇和液体soc培养基至电击后的电穿孔容器中，混合后获得电击样品；
19、s44.将所述电击样品转移至离心管中，常温下培养细胞以复苏，再转移至培养板上涂布均匀，进行抗性板培养；
20、s55.挑取抗性板生长的单菌落15-20个进行pcr检测验证，将验证的阳性菌落挑取至液体soc培养基中培养12-18h，使用灭菌的40％甘油与菌液体积比为1:1混匀，放置-70℃冰箱保菌。
21、根据上述技术方案，优选地，步骤s11包括：将所述c3040感受态细胞在冰上解冻，搅拌使其浓度均匀，取25-30ul；将1ul连接产物dna添加至冰上预冷的离心管底部，再将解冻取出的感受态细胞加入管中，混匀后放置冰上，获得所述dna/细胞混合物。
22、根据上述技术方案，优选地，步骤s33中，所述选取150ul、1m山梨醇以及650ul液体soc培养基加入至电击后的电穿孔容器中。
23、根据上述技术方案，优选地，步骤s55中，所述40％甘油采用纯甘油与双蒸水体积比4:6混匀，高压灭菌15min。
24、本专利技术的有益效果是：
25、本专利技术采用高保守的大肠杆菌c3040菌株制备电转感受态细胞，避开了多片段连接时外源dna被降解，防止发生同源重组而导致的片段丢失等，使其高效稳定融合多个大片段，并建立了电转c3040感受态细胞的电击转化方法，比商业感受态细胞转化效率高，在实验室可以长期保存扩繁，随用随制，大大降低成本，并保证感受态细胞能长期供应；
26、本专利技术为基因组文库构建、生物传感本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种用于大片段载体构建的感受态细胞的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述一种用于大片段载体构建的感受态细胞的制备方法，其特征在于，步骤S1包括：将低温保存的大肠杆菌C3040菌株置于SOC培养基平板划线活化，37℃下过夜培养；挑取培养板上一个单菌落接种于液体LB培养基，37℃下过夜培养12h以上，获得过夜培养菌。
3.根据权利要求2所述一种用于大片段载体构建的感受态细胞的制备方法，其特征在于，步骤S2包括：转移0.5mL所述过夜培养菌至液体SOC培养基的摇瓶中，37℃、200rpm培养2-6h；定时检测所述液体LB培养基中培养液的OD600值处于0.5-0.6时，取出摇瓶，置于冰上冷却至少15min。
4.根据权利要求1所述一种用于大片段载体构建的感受态细胞的制备方法，其特征在于，步骤S3、S4中，离心条件为：在4℃、3900-4000rpm下离心15min。
5.根据权利要求4所述一种用于大片段载体构建的感受态细胞的制备方法，其特征在于，步骤S4中所述灭菌的冰水由双蒸水经过高压灭菌60min，取出冷却至
6.根据权利要求3所述一种用于大片段载体构建的感受态细胞的制备方法，其特征在于，步骤S5、S6中，所述10％甘油采用纯甘油与双蒸水体积比1:9混匀，再高压灭菌15min。
7.一种用于大片段载体构建的感受态细胞的转化方法，采用权利要求1-6中任意一项的制备方法制备出的所述C3040感受态细胞，其特征在于，包括以下步骤：
8.根据权利要求7所述一种用于大片段载体构建的感受态细胞的转化方法，其特征在于，步骤S11包括：将所述C3040感受态细胞在冰上解冻，搅拌使其浓度均匀，取25-30uL；将1uL连接产物DNA添加至冰上预冷的离心管底部，再将解冻取出的感受态细胞加入管中，混匀后放置冰上，获得所述DNA/细胞混合物。
9.根据权利要求8所述一种用于大片段载体构建的感受态细胞的转化方法，其特征在于，步骤S33中，所述选取150uL、1M山梨醇以及650uL液体SOC培养基加入至电击后的电穿孔容器中。
10.根据权利要求7所述一种用于大片段载体构建的感受态细胞的转化方法，其特征在于，步骤S55中，所述40％甘油采用纯甘油与双蒸水体积比4:6混匀，高压灭菌15min。
...【技术特征摘要】
1.一种用于大片段载体构建的感受态细胞的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述一种用于大片段载体构建的感受态细胞的制备方法，其特征在于，步骤s1包括：将低温保存的大肠杆菌c3040菌株置于soc培养基平板划线活化，37℃下过夜培养；挑取培养板上一个单菌落接种于液体lb培养基，37℃下过夜培养12h以上，获得过夜培养菌。
3.根据权利要求2所述一种用于大片段载体构建的感受态细胞的制备方法，其特征在于，步骤s2包括：转移0.5ml所述过夜培养菌至液体soc培养基的摇瓶中，37℃、200rpm培养2-6h；定时检测所述液体lb培养基中培养液的od600值处于0.5-0.6时，取出摇瓶，置于冰上冷却至少15min。
4.根据权利要求1所述一种用于大片段载体构建的感受态细胞的制备方法，其特征在于，步骤s3、s4中，离心条件为：在4℃、3900-4000rpm下离心15min。
5.根据权利要求4所述一种用于大片段载体构建的感受态细胞的制备方法，其特征在于，步骤s4中所述灭菌的冰水由双蒸水经过高压灭菌60min，取出冷却至常温，再放置冰箱中冷却至5℃以下。
【专利技术属性】
技术研发人员：刘伟，胡保安，张云冬，王天祥，董先锋，李素江，殷瑞林，张珍，张勇，曹凯，吴玉涛，
申请(专利权)人：中交天津生态环保设计研究院有限公司，
类型：发明
国别省市：
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