【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物，尤其涉及一种基于taq酶和bst酶的等温扩增方法。
技术介绍
1、碳青霉烯类抗生素是一类广谱抗生素，属于β-内酰胺类抗生素的亚类。它们具有很强的抗菌活性，特别对于革兰阴性菌和某些革兰阳性菌具有较高的效果。碳青霉烯类抗生素被广泛用于治疗多种感染，包括呼吸道、泌尿道、皮肤和软组织等感染。碳青霉烯类抗生素的代表药物是头孢曲松(ceftazidime)和头孢他啶(cefepime)。它们在临床上常作为静脉给药的选择，用于治疗复杂的感染，如医院获得性肺炎、腹腔感染和血流感染等。碳青霉烯类抗生素通过抑制细菌细胞壁的合成，阻断了细菌的生长和繁殖。
2、碳青霉烯耐药是当今世界面临的严重问题之一。细菌通过产生碳青霉烯酶等机制对碳青霉烯类抗生素产生耐药性，并通过水平基因转移在细菌之间传播，导致耐药性快速扩散。这对临床治疗构成了严重挑战，限制了可用于治疗感染的药物选项，使感染难以有效控制，增加严重并发症、延长住院时间，并增加患者的死亡风险。在医疗环境中，碳青霉烯耐药细菌尤其具有危害，可以在医院内传播，引发医院获得性感染，增加医疗机构控制感染的难度。这种耐药性也成为全球公共卫生问题，威胁到人类健康。碳青霉烯类抗生素耐药性正在快速传播,导致临床上肠杆菌等产生碳青霉烯酶的细菌引起的感染无法用碳青霉烯类药物治疗。目前,临床上最常见的碳青霉烯酶类型是kpc、ndm和oxa-48等,主要来源于肺炎克雷伯菌和大肠杆菌。细菌培养、质谱分析、抗原检测以及分子检测等方法可以用于检测临床样本中的碳青霉烯酶或其编码基因。分子检测方法,如聚合酶
3、等温核酸扩增技术是一种在恒定温度下进行的核酸扩增方法,无需进行反复的热变性和退火过程。等温扩增技术的一个重要优势是其简化的操作流程。传统的pcr方法需要多个温度循环，包括高温的变性和退火阶段，而等温扩增技术能够在恒定温度下进行，省去了温度变化的步骤。这使得等温扩增更加快速、方便且易于自动化。目前常用的等温扩增方法包括nasba、tma，rpa和lamp等温扩增技术，它们各自具有特定的优势和适用范围。其中，环介导等温扩增(lamp)技术是一种备受关注的等温扩增方法，具有许多独特的特点和广泛的应用领域。lamp技术是由多个引物和bst dna聚合酶介导的一种等温扩增方法。它的反应体系包括目标dna序列、两对特异性引物(f3和b3)以及两对循环引物(f ip和bip)，以及bstdna聚合酶。这些引物分别包括外部引物(f3和b3)和内部引物(f ip和bip)。lamp反应的优点之一是其高度特异性。由于多条引物的作用，lamp技术能够在等温条件下高效地扩增目标dna序列，同时具有极低的非特异性扩增的可能性。另一个优点是lamp反应的高效率和快速性。在恒定的温度下，lamp技术能够在相对较短的时间内实现高度特异性的核酸扩增，通常只需要30分钟到1小时即可获得结果。这与传统的pcr方法相比，显著缩短了反应时间。lamp技术也存在一些缺点。首先，由于引物的多样性和复杂性，lamp反应的引物设计和优化相对较为复杂，需要进行大量的实验验证。这增加了实验室操作的难度和时间成本。其次，lamp反应产生的大量扩增产物往往呈现为特征性的结构，如螺旋状或螺旋环状，这可能导致结果解读的困难。此外，lamp扩增技术在特定条件下，可能出现假阳性结果。这是由于lamp反应的特殊特点所致，lamp引物的多重作用和bst dna聚合酶的高酶活性，使得lamp反应在一些情况下可能扩增非特异性的dna序列。这种假阳性结果的出现可能是由于引物设计不当、起始dna污染以及污染和交叉污染等原因引起的。
4、lamp等温扩增技术在各个领域都有广泛的应用。其快速、灵敏和简便易行的特点使其在病原体检测、食品安全监测和环境监测等方面发挥着重要作用。特别是在快速疫情监测和早期诊断、食品生产和供应链中的病原体污染检测以及环境监测等领域，lamp扩增已经取得了显著的成果。然而，尽管lamp扩增在这些领域取得了成功，仍然存在一些需要改进的方面。首先，引物设计的特异性和灵敏度仍然是关键的挑战。更精确的引物设计方法和策略可以帮助避免假阳性结果，提高扩增的准确性和可靠性。此外，lamp扩增的自动化和集成化也是未来需要努力改进的方向。自动化的lamp扩增平台可以提高实验的标准化和可重复性，并且更适用于大规模样品处理。同时，lamp扩增的成本和时间效率也是需要改进的方面。虽然lamp扩增相对于传统pcr已经具有较快的扩增速度，但仍有进一步缩短扩增时间的需求。降低扩增成本对于促进lamp技术的广泛应用也是非常重要的。
5、在微生物诊断领域，对碳青霉烯酶或其基因的检测有多种方法。以下是关于碳青霉烯酶耐药基因检测方法的四种常见方法的简要介绍。
6、首先，细菌培养法是一种传统的碳青霉烯酶耐药基因检测方法。该方法涉及将细菌分离并培养在含有碳青霉烯类抗生素的培养基上，然后对菌落进行鉴定和敏感性测试。通过观察菌落的生长和抗生素敏感性，可以间接推测细菌是否携带碳青霉烯酶耐药基因。其优点是可以提供有关细菌的详细信息，如菌种鉴定和抗生素敏感性。此外，它还可以为后续研究提供活性细菌菌株。
7、第二.质谱检测法是一种基于质谱技术的碳青霉烯酶耐药基因检测方法。它使用质谱仪分析样品中的碳青霉烯酶蛋白质，并根据蛋白质的质谱图谱来确定是否存在碳青霉烯酶耐药基因。其优点是具有高度的灵敏性和特异性，能够检测多种碳青霉烯酶耐药基因的存在。此外，它的操作相对简单，且时间较短。
8、第三，抗原检测法是一种基于抗原与抗体特异性结合的碳青霉烯酶耐药基因检测方法。通过使用特异性的抗体与样品中的碳青霉烯酶结合，可以检测到碳青霉烯酶的存在。其优点是可以快速的检测和操作流程简单。它可以用于快速筛查大量样品，并且有可能实现便携化。
9、第四，分子检测法是一种基于核酸扩增技术的碳青霉烯酶耐药基因检测方法。其中目前以pcr(聚合酶链式反应)技术为主。这些方法通过扩增和检测目标基因的核酸序列来确定碳青霉烯酶耐药基因的存在。分子检测法具有高度的灵敏性和特异性，能够准确检测碳青霉烯酶耐药基因的存在，并且可以提供详细的基因型信息。这些方法通常具有较短的检测时间，能够快速获得结果。
10、以上四类检测碳青霉烯酶或者碳青霉烯基因方法均有各自的缺点。细菌培养方法缺点是需要较长的时间来培养和鉴定细菌，通常需要数天到数周的时间。此外，一些细菌可能难以培养，导致假阴性结果。此外，细菌培养法对于检测低水平的碳青霉烯酶耐药基因存在限制。
11、质谱检测法的主要缺点是设备和设施成本较高，限制了其在一些实验室或医疗机构中的应用。此外，对于复杂样品的分析，可能需要额外的前处理步骤，增加了分析的复杂性。
12、抗原检测法的缺点是检测法的灵敏性受到限制，特别是对于低水平的碳青霉烯酶耐本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种基于taq酶和bst酶的等温扩增方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种基于taq酶和bst酶的等温扩增方法，其特征在于，所述S1中，引物与引物之间的吉布斯自由能在-10以上。
3.根据权利要求1所述的一种基于taq酶和bst酶的等温扩增方法，其特征在于，所述S2中，2ul 10x LAMP引物包括4μM F3/B3、4-6μM LF/LB和16μM FIP/BIP。
4.根据权利要求1所述的一种基于taq酶和bst酶的等温扩增方法，其特征在于，所述S2中，其中10x反应缓冲液包括300-400mM Tris-HCl、150-200mM(NH4)2SO4、200-300mM KCl、20mM MgSO4和1％Tween-20。
5.根据权利要求1所述的一种基于taq酶和bst酶的等温扩增方法，其特征在于，所述S2中，Bst 3.0的浓度为8000U/ml，所述taq polymerase的浓度为0.1U/ul。
6.根据权利要求1所述的一种基于taq酶和bst酶的等温扩增方法，其特征在于，所
7.根据权利要求1所述的一种基于taq酶和bst酶的等温扩增方法，其特征在于，所述S3中，具体包括以下步骤：
8.根据权利要求1所述的一种基于taq酶和bst酶的等温扩增方法，其特征在于，所述S3中，具体包括以下步骤：
...【技术特征摘要】
1.一种基于taq酶和bst酶的等温扩增方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种基于taq酶和bst酶的等温扩增方法，其特征在于，所述s1中，引物与引物之间的吉布斯自由能在-10以上。
3.根据权利要求1所述的一种基于taq酶和bst酶的等温扩增方法，其特征在于，所述s2中，2ul 10x lamp引物包括4μm f3/b3、4-6μm lf/lb和16μm fip/bip。
4.根据权利要求1所述的一种基于taq酶和bst酶的等温扩增方法，其特征在于，所述s2中，其中10x反应缓冲液包括300-400mm tris-hcl、150-200mm(nh4)2so4、200...
【专利技术属性】
技术研发人员：丁华敏，荆晶，黄韵，郭羽晨，李铁军，王连升，
申请(专利权)人：上海市浦东新区浦南医院，
类型：发明
国别省市：
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