【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于体外诊断，具体涉及一种定性检测脂联素的胶体金试剂盒及其制备方法。
技术介绍
1、近几十年，糖尿病发病率快速增加，糖尿病前期是发生糖尿病之前的一个过渡阶段，大约30％糖尿病前期患者最终发展成为糖尿病。糖尿病病人一有高血糖出现，即无法逆转，病人需要终生服药，但如果在糖尿病前期发现，就可以通过生活方式即药物的干预，逆转该疾病，从而达到预防糖尿病的目的。大量针对不同人群的研究发现，糖尿病前期患者的脂联素水平明显低于健康对照，而且脂联素水平越低，发生糖尿病的风险就越高。因此，通过对脂联素的检测，可以筛查鉴别糖尿病前期患者。并且通过监测脂联素的水平来观察糖尿病患者的病情控制与并发症的发展趋势。
2、除此之外，监测脂联素水平亦可用于：1)监测胰岛素增敏剂的治疗效果，用药后脂联素升高越高，即显示该病人对治疗反映越良好；2)可以用于作为2型糖尿病分型的辅助诊断，脂联素水平低的2型糖尿病病人，说明其胰岛素抵抗高，反之脂联素水平高的患者，则可能是由胰岛素分泌不足引起的；3)判断心血管疾病的相关患病风险；4)代谢性功能的患者如肝肾异常，代谢性患者的脂联素会出现异常，导致结果的偏高。
3、目前检测脂联素的方法主要有化学发光法、胶乳增强免疫比浊法和免疫胶体金或乳胶标记技术。化学发光法：性能指标优良，精密度、灵敏度较高。是临床上使用最为广泛的方法学，但是配套的仪器价格昂贵，而且需要较长的时间才能得到结果，开展有一定的难度。比较典型的产品是亚辉龙等发光产品。脂联素测定试剂盒(胶乳增强免疫比浊法)：灵敏度较好，但是要搭配仪器
4、胶体金通常直径在5～50nm之间且分散性良好的球形金纳米颗粒(aunps)，当金纳米颗粒发生聚集后，所产生的共振吸收波长发生红移，其溶液呈现紫色或者紫红色。通过肉眼直接观测颜色变化，即可判断金纳米颗粒是否发生团聚。通过对金纳米颗粒表面进行脂联素抗体修饰，其能与待测样中的脂联素产生特异性结合，在吸水纸的作用下移动至检测区和质控区，与特异性抗体进行结合聚集形成“抗体-脂联素-抗体”夹心复合物沉积，通过其颜色变化即可定性检测脂联素水平。
5、然而，由于普通方法制备的金纳米颗粒粒径太小，表面化学活性很高，容易自发发生聚集，导致试剂失效，其储存稳定性较差。另外，普通胶体金一般为带负电的疏水胶溶液，其亲水性较差，在检测时易吸附沉积于膜材，导致检测灵敏度不高，易导致假阴性结果。彩色乳胶微球的粒径比胶体金颗粒大(彩色乳胶微球粒径在200nm-400nm)，相对灵敏度更高。但彩色乳胶微球的染料包覆相对比较复杂，其目测的颜色变化分辨性较差，易导致假阳性结果；且为了增强与抗体结合性，需要进行表面修饰改性，增加了制备成本。
技术实现思路
1、针对以上现有技术存在的缺点和不足之处，本专利技术的首要目的在于提供一种定性检测脂联素的胶体金试剂盒的制备方法。
2、本专利技术的另一目的在于提供一种通过上述方法制备得到的胶体金试剂盒。
3、本专利技术目的通过以下技术方案实现：
4、一种定性检测脂联素的胶体金试剂盒的制备方法，包括如下制备步骤：
5、(1)多孔壳聚糖微球的制备：
6、将壳聚糖和pva溶解于醋酸溶液中得到混合溶液，喷雾干燥，得到壳聚糖微球；将所得壳聚糖微球加入到碱性溶液中进行碱溶处理去除pva成分，过滤洗涤后在密闭的干燥箱中用戊二醛蒸汽交联，得到多孔壳聚糖微球；
7、(2)壳聚糖负载胶体金的制备：
8、将多孔壳聚糖微球加入到氯金酸溶液中搅拌混合均匀，加热至70～100℃，再加入柠檬酸三钠溶液搅拌反应，反应产物经过滤、洗涤、干燥，得到壳聚糖负载胶体金颗粒；
9、(3)抗体标记物结合垫的制备：
10、将壳聚糖负载胶体金颗粒加入到k2co3溶液中分散均匀，再加入脂联素抗体进行标记反应，反应完成后加入bsa(牛血清白蛋白)进行封闭，离心收集沉淀，得到抗体标记物；然后将其与海藻糖用标记物缓冲液重悬稀释后喷涂于玻璃纤维膜上，干燥后得到抗体标记物结合垫；
11、(4)检测线和质控线的制备：
12、将硝酸纤维膜贴在pvc板上，在膜上划线检测区工作液和质控区工作液，干燥后分别得到检测线和质控线；所述检测区工作液为脂联素单抗的包被液稀释液，质控区工作液为羊抗鼠igg的包被液稀释液；
13、(5)样品垫的制备：
14、将样品垫处理液涂布在玻璃纤维膜上，干燥后得到样品垫；
15、(6)胶体金试剂盒的制备：
16、在pvc板依次相互搭接地粘贴吸水纸、硝酸纤维素膜、抗体标记物结合垫、样品垫；从pvc板的一端至另一端依次连接，然后切割成适当宽度的试剂条，并将试剂条组装成试剂盒(卡)。
17、进一步地，步骤(1)中所述pva的加入量为壳聚糖质量的1％～15％。本专利技术中采用pva作为壳聚糖微球的致孔剂，通过后续碱溶处理去除pva成分，可在壳聚糖微球表层形成多孔结构，利用壳聚糖的正电性及多孔结构吸附负电性及小粒径的金纳米颗粒，从而完成金纳米颗粒的稳定负载。
18、进一步地，步骤(1)中所述碱性溶液是指浓度为0.1～1mol/l的koh水溶液。
19、进一步地，步骤(2)中所述多孔壳聚糖微球、氯金酸和柠檬酸三钠加入的质量比为10:0.5～2:1～5。
20、进一步地，步骤(3)中所述k2co3溶液的ph值为7.5～8.5；所述脂联素抗体的加入量为壳聚糖负载胶体金颗粒质量的1％～5％。
21、进一步地，步骤(3)中所述标记物缓冲液是指含有peg 8～12wt％、蔗糖3～8wt％、酪蛋白0.2～1wt％，防腐剂0.1～0.5wt％、表面活性剂1～3wt％的pbs缓冲液。
22、进一步地，步骤(3)中所述海藻糖的加入量为抗体标记物质量的20％～100％。
23、进一步地，步骤(4)中所述包被液是指含有0.5～4wt％蔗糖和0.1～0.5wt％防腐剂的pbs缓冲液。
24、进一步地，步骤(5)中所述样品垫处理液是指含有鼠igg 0.1～1.0mg/ml、k2co31～6wt％、表面活性剂0.05～0.5wt％、bsa 1～5wt％、防腐剂0.1～0.5wt％和红细胞(rbc)0.1～0.5mg/ml的pbs缓冲液。
25、一种定性检测脂联素的胶体金试剂盒，通过上述方法制备得到。
26、本专利技术所得定性检测脂联素的胶体金试剂盒的结构示意图如图1所示。包括pvc板及pvc板上依次相互搭接的样品垫、抗体标记物结合垫、硝酸纤维素膜及吸水纸构成；所述硝酸纤维素膜上划线有t线(检测线)和c线(质控线)。
27、与现有技术相比，本本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种定性检测脂联素的胶体金试剂盒的制备方法，其特征在于，包括如下制备步骤：
2.根据权利要求1所述的一种定性检测脂联素的胶体金试剂盒的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述PVA的加入量为壳聚糖质量的1％～15％。
3.根据权利要求1所述的一种定性检测脂联素的胶体金试剂盒的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述碱性溶液是指浓度为0.1～1mol/L的KOH水溶液。
4.根据权利要求1所述的一种定性检测脂联素的胶体金试剂盒的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述多孔壳聚糖微球、氯金酸和柠檬酸三钠加入的质量比为10:0.5～2:1～5。
5.根据权利要求1所述的一种定性检测脂联素的胶体金试剂盒的制备方法，其特征在于，步骤(3)中所述K2CO3溶液的pH值为7.5～8.5；所述脂联素抗体的加入量为壳聚糖负载胶体金颗粒质量的1％～5％。
6.根据权利要求1所述的一种定性检测脂联素的胶体金试剂盒的制备方法，其特征在于，步骤(3)中所述标记物缓冲液是指含有PEG 8～12wt％、蔗糖3～8wt％、酪蛋白0.2～1wt％，防腐剂0
7.根据权利要求1所述的一种定性检测脂联素的胶体金试剂盒的制备方法，其特征在于，步骤(3)中所述海藻糖的加入量为抗体标记物质量的20％～100％。
8.根据权利要求1所述的一种定性检测脂联素的胶体金试剂盒的制备方法，其特征在于，步骤(4)中所述包被液是指含有0.5～4wt％蔗糖和0.1～0.5wt％防腐剂的PBS缓冲液。
9.根据权利要求1所述的一种定性检测脂联素的胶体金试剂盒的制备方法，其特征在于，步骤(5)中所述样品垫处理液是指含有鼠IgG 0.1～1.0mg/mL、K2CO31～6wt％、表面活性剂0.05～0.5wt％、BSA 1～5wt％、防腐剂0.1～0.5wt％和RBC 0.1～0.5mg/mL的PBS缓冲液。
10.一种定性检测脂联素的胶体金试剂盒，其特征在于，通过权利要求1～9任一项所述的方法制备得到。
...【技术特征摘要】
1.一种定性检测脂联素的胶体金试剂盒的制备方法，其特征在于，包括如下制备步骤：
2.根据权利要求1所述的一种定性检测脂联素的胶体金试剂盒的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述pva的加入量为壳聚糖质量的1％～15％。
3.根据权利要求1所述的一种定性检测脂联素的胶体金试剂盒的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述碱性溶液是指浓度为0.1～1mol/l的koh水溶液。
4.根据权利要求1所述的一种定性检测脂联素的胶体金试剂盒的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述多孔壳聚糖微球、氯金酸和柠檬酸三钠加入的质量比为10:0.5～2:1～5。
5.根据权利要求1所述的一种定性检测脂联素的胶体金试剂盒的制备方法，其特征在于，步骤(3)中所述k2co3溶液的ph值为7.5～8.5；所述脂联素抗体的加入量为壳聚糖负载胶体金颗粒质量的1％～5％。
6.根据权利要求1所述的一种定性检测脂联素的胶体金试剂盒的制备方法，其特征在于，步骤(3)中所述标记物缓冲液是指...
【专利技术属性】
技术研发人员：钟铃，周鹏程，赖华，吴秋凤，丘招胜，
申请(专利权)人：广东优尼德生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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