【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物检测领域，具体涉及一种基于纳米复合材料构建检测gpc3的电化学夹心型适配体传感器。
技术介绍
1、原发性肝细胞癌(hcc)是最常见的恶性肿瘤之一，磷脂酰肌醇聚糖3(gpc3)，作为一种新兴的肿瘤标志物有特异性高、灵敏度高等优点。常用的gpc3检测方法有荧光免疫分析法、化学发光免疫分析法、比色免疫法等。公开号cn113203718a的专利技术专利，涉及一种gpc3测荧光共振能量转移的检测方法；公开号cn112014577a的专利技术专利，涉及一种有关免疫检测的方法，提供了一种gpc3检测灵敏度的试剂盒的制备方法。但目前现有的方案存在着操作复杂、成本较高、特异性差等缺点。因此，需要建立一种快速、灵敏、操作简单的gpc3检测方法。
技术实现思路
1、本专利技术所要解决的技术问题是提供一种基于磷掺杂还原性氧化石墨烯-氯化血红素-钯(prgo-hemin-pd)的纳米复合材料构建传感器来检测gpc3的方法，gpc3的最低检测限为0.001ng/ml。
2、本专利技术的检测原理为：首先制备了大比表面积、高电导率、良好原位电化学活性和良好生物相容性的prgo-hemin-pd纳米复合材料；通过酰胺反应将prgo-hemin-pd与gpc3适配体(gpc3apt)偶联，制备出可与gpc3特异性结合的prgo-hemin-pd-gpc3apt信号探针；通过静电吸附作用逐步将gpc3apt、gpc3和prgo-hemin-pd-gpc3apt信号探针修饰在金@邻苯二胺沉积
3、本专利技术按照以下步骤进行：
4、步骤1：prgo-hemin-pd-gpc3apt信号探针的制备
5、(1)磷掺杂还原氧化石墨烯(prgo)的制备：将氧化石墨烯(go)溶于水中，超声破碎得到氧化石墨烯(go)溶液，将go溶液与一水合次亚磷酸钠(nah2po2·h2o)混合均匀，搅拌后放入特氟龙内衬的高压反应釜中进行水热反应后，冷却，并将产生的沉淀离心洗涤，干燥。
6、(2)磷掺杂还原性氧化石墨烯-氯化血红素(prgo-hemin)的制备：将hemin溶于超纯水和氨水中，得hemin溶液；然后将prgo溶液和hemin溶液混合，搅拌。然后，在混合溶液中加入水合肼，水浴反应得到prgo-hemin纳米材料；
7、(3)磷掺杂还原氧化石墨烯-氯化血红素-钯(prgo-hemin-pd)纳米复合材料的制备：取上述得到的prgo-hemin溶液加入na2pdcl4和水合肼，搅拌、离心，洗涤并干燥，得到prgo-hemin-pd纳米复合材料。
8、(4)磷掺杂还原氧化石墨烯-氯化血红素-钯-gpc3适配体(prgo-hemin-pd-gpc3apt)信号探针的制备：prgo-hemin-pd纳米复合材料与gpc3apt震荡混匀，孵育过夜，加入bsa溶液，进行封闭，常温孵育；离心，除去上清液，重新分散在超纯水中，得到prgo-hemin-pd-gpc3apt识别探针。
9、步骤2：电极的修饰与电化学适配体传感器的构建
10、(1)au@popd nps/spe的制备：将丝网印刷电极(spe)置于稀硫酸(h2so4)溶液中，采用循环伏安法(cv)进行活化，将活化的电极浸入氯金酸@邻苯二胺溶液中，并用电沉积技术将au@popd nps沉积到电极表面，进行恒电位沉积，清洗、干燥，得到au@popd nps/spe；
11、(2)gpc3apt/au@popd nps/spe传感界面的制备：将适配体(gpc3apt)滴在au@popdnps/spe界面上，孵育，清洗、干燥，随后在传感界面滴加牛血清白蛋白(bsa)溶液，干燥，得到gpc3apt/au@popd nps/spe；
12、(3)prgo-hemin-pd-gpc3apt信号探针的制备：将prgo-hemin-pd纳米复合材料与gpc3apt混匀，孵育，加入bsa溶液进行封闭，孵育，离心后除去上清液，重新分散在超纯水中，得到prgo-hemin-pd-gpc3apt识别探针。
13、(4)prgo-hemin-pd-gpc3apt/gpc3apt/au@popd nps/spe电化学适配体传感器的构建：将prgo-hemin-pd-gpc3apt滴加到gpc3apt/au@popd nps/spe界面上，孵育，清洗、干燥，得到prgo-hemin-pd-gpc3apt/gpc3apt/au@popdnps/spe电化学适配体传感器。
14、步骤3：gpc3的工作曲线绘制
15、(1)将标准gpc3溶液滴加到步骤2得到的电化学适配体传感器中，孵育、清洗、干燥，得到prgo-hemin-pd-gpc3apt/gpc3/gpc3apt/au@popd nps/spe工作电极；
16、(2)将工作电极放入磷酸缓冲盐溶液(pbs)中，采用电化学工作站的差分脉冲伏安法(dpv)扫描，记录其峰电流。
17、(3)分别对不同浓度的gpc3进行检测，记录峰值电流；根据传感器的电流响应值与gpc3浓度的关系，绘制工作曲线，计算出该方法的最低检测限。
18、步骤4：实际血清样本中gpc3的检测
19、(1)在步骤2得到的电化学适配体传感器上，滴加待测实际血清样本，孵育、清洗、干燥、得到工作电极。
20、(2)将工作电极放入pbs中，采用电化学工作站的dpv扫描，记录其峰电流。
21、(3)根据步骤3所述的工作曲线，计算求出所述待测实际样品中gpc3的浓度。
22、进一步，所述步骤1中，go和hemin溶液浓度为1mg/ml。
23、进一步，所述步骤1中，go中加入nah2po2·h2o的质量比为1：10。
24、进一步，所述步骤1中，制备prgo溶液，反应温度为180℃，时间为12h。
25、进一步，所述步骤1中，水合肼的质量分数为80％。
26、进一步，所述步骤2中，混合溶液中haucl4的质量分数为0.01％，opd溶液的浓度为0.25mol/l，沉积电位为0.4v，沉积时间为120s。
27、进一步，所述步骤2中，prgo-hemin-pd溶液的浓度为1.0mg/ml。
28、进一步，所述步骤2中，bsa溶液的质量分数为1％。
29、优选，所述步骤1中，gpc3apt的碱基序列为5′-nh2-c6-taacgctgaccttagctgcatggctttacatgttcca-3′；...
【技术保护点】
1.一种基于磷掺杂还原性氧化石墨烯-氯化血红素-钯纳米复合材料PrGO-Hemin-PdNPs构建检测GPC3的电化学夹心型适配体传感器，按以下步骤进行：
2.按照权利要求1所述的传感器，其特征在于：步骤1中，GO和Hemin溶液浓度都为1mg/mL。
3.按照权利要求1所述的传感器，其特征在于：步骤1中，GO中加入NaHPO2·H2O的质量比为1:10。
4.按照权利要求1所述的传感器，其特征在于：步骤1中，制备PrGO溶液，反应温度为180℃，时间为12h。
5.按照权利要求1所述的传感器，其特征在于：步骤1中，水合肼的质量分数为80％。
6.按照权利要求1所述的传感器，其特征在于：步骤2中，混合溶液中HAuC14的质量分数为0.01％，OPD溶液的浓度为0.25mol/L，沉积电位为0.4V，沉积时间为120s。
7.按照权利要求1所述的传感器，其特征在于：GPC3Apt的碱基序列为5′-NH2-C6-TAACGCTGAC CTTAGCTGCATGGCTTTACATGTTCCA-3′。
8.
9.按照权利要求1所述的传感器，其特征在于：步骤3和4中所述述GPC3Apt的浓度为10μM，GPC3的孵育温度为25℃，孵育时间为35min；PBS浓度为0.2M，pH值为7.5；DPV线性扫描范围0.3V～0.9V，扫描速率为0.01V/s。
...【技术特征摘要】
1.一种基于磷掺杂还原性氧化石墨烯-氯化血红素-钯纳米复合材料prgo-hemin-pdnps构建检测gpc3的电化学夹心型适配体传感器，按以下步骤进行：
2.按照权利要求1所述的传感器，其特征在于：步骤1中，go和hemin溶液浓度都为1mg/ml。
3.按照权利要求1所述的传感器，其特征在于：步骤1中，go中加入nahpo2·h2o的质量比为1:10。
4.按照权利要求1所述的传感器，其特征在于：步骤1中，制备prgo溶液，反应温度为180℃，时间为12h。
5.按照权利要求1所述的传感器，其特征在于：步骤1中，水合肼的质量分数为80％。
6.按照权利要求1所述的传感器，其特征在于：步骤2中，混合溶液中hauc...
【专利技术属性】
技术研发人员：梁晋涛，郭菲，梁建璐，周治德，
申请(专利权)人：桂林电子科技大学，
类型：发明
国别省市：
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