【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物，公开了一种溶藻弧菌核酸快速检测试剂盒及检测方法。
技术介绍
1、溶藻弧菌( vibrio alginolyticus )属弧菌科、弧菌属，兼性厌氧，是革兰氏阴性嗜盐菌，其形态为短杆菌，首尾相连可呈现“c”或“s”形，在1961被发现，因其生活特性与副溶血弧菌相似，bergey氏细菌学鉴定手册第八版列为副溶血性弧菌的一个生物型，以往称为副溶血弧菌生物ⅱ，直至1981年，sakazaki等才提出将其作为一个独立的物种看待。 溶藻弧菌不具有芽孢、荚膜，因此单个溶藻弧菌的抗逆能力很差，但其往往会聚集成群形成生物被膜，以抵抗抗生素的毒害以及抵御其他的不良环境条件，提高其存活几率，此外，在营养条件良好时，溶藻弧菌可以形成鞭毛，有利于其在环境中泳动和攻击宿主细胞。
2、溶藻弧菌广泛分布与世界各地海水及海口处，与哈维氏弧菌、副溶血弧菌并称海洋三大优势菌，且其数量居海洋弧菌之首。其致病过程包括粘附、侵袭、体内增值及产生毒素等步骤，主要通过在侵袭和增值过程中对机体造成的细胞核组织损伤及毒素干扰和破坏机体的局部或全身的正常新陈代谢或机能而致病，这些过程主要与其产生的各种毒力因子有关，溶藻弧菌的毒力因子主要有黏附素、胞外产物（碱性丝氨酸蛋白酶、溶血素、胶原酶等）、外膜蛋白及摄铁系统等。溶藻弧菌最适生长温度为17℃~35℃，因此在夏季的海水里大量增值，感染也于夏季多发，在沿海及入海口的海水中均可检出，尤其在我国东南沿海地区溶藻弧菌是水产养殖业易感细菌之一，对鱼类，虾蟹类和贝类等都易造成感染，感染后主要表现为表皮发生溃疡、出
3、目前，用于诊断溶藻弧菌的方法主要有病原学诊断、免疫学诊断、核酸检测等。病原学诊断主要以细菌分离培养为主，细菌培养是诊断溶藻弧菌的“金标准”，溶藻弧菌生长过程必须有na+离子存在（2%~10%nacl），在含量3% nacl环境中生长最佳，在细菌培养后经过一系列生化反应鉴定种属，通常耗时3-5天，在经典的弧菌选择性培养基硫代硫酸盐胆盐蔗糖琼脂培养基（thiosulfate citrate bile salts sucrose agar culture medium，tcbs）上因对蔗糖的发酵不同使菌落呈黄色，菌落为圆形、凸起、光滑，直径2-3mm，菌落粘稠不易挑取则初步区分为溶藻弧菌。该法虽然是鉴定细菌感染最基础、最可靠的方法，但其培养时间长，鉴别复杂。免疫学诊断主要以酶联免疫吸附实验为主，一般需预先在固相载体上包被抗体或者抗原，然后在一定条件下进行免疫学反应，最后将免疫复合物所携带的酶分子转化为有特定颜色的化合物，通过对产物颜色的化合物分析对待测样本进行定量定性，常规实验室检测方法是利用灭活溶藻弧菌注射免疫试验获得抗血清建立检测体系，该方法虽然可定量，且特异性较好，但是其操作复杂，通常需要高含量的抗原或抗体含量，很难实现在现场快速检测。
4、与此相比，溶藻弧菌的核酸诊断理论上是最佳的诊断方法，它既可有效地确诊蜱传脑炎患者又可对环境中的感染因素包括疫水、水产品中是否含有溶藻弧菌做出判定，目前已有多种溶藻弧菌的核酸诊断方法包括普通pcr、rt-pcr、多重pcr等。这些核酸检测法均依赖于热循环仪器，对操作环境及人员有较高的要求，扩增时间长，在沿海地区由于条件限制无法实现现场检测，因此，开发了利于现场检测的恒温核酸扩增方法，目前有利用环介导恒温扩增（loop-mediated isothermal amplification，lamp）检测溶藻弧菌，但是方法引物设计复杂，许多条引物协同扩增。
技术实现思路
1、本专利技术的目的是针对目前对溶藻弧菌感染的诊断技术及溶藻弧菌污染环境评估存在的缺陷，提供一种新型的基于rpa技术与crispr体系结合的，具有特异，灵敏，快速，简便，高效的溶藻弧菌核酸检测试剂盒及检测方法。
2、为了实现上述目的本专利技术采取的技术方案是：提供一种溶藻弧菌的核酸检测试剂盒，该试剂盒包括：
3、（1）rpa冻干颗粒：噬菌体重组酶uvsx及其辅助因子uvsy、dna聚合酶、单链dna结合蛋白（gp32）、dntps；
4、（2）缓冲液：rehydration buffer；
5、（3）醋酸镁；
6、（4）rpa反应引物：
7、f1：gaaattaatacgactcactatagggggatatggccaccacgatgaatcgttagctca；
8、r1：cagaggaaaatgtctctgcagcagaagtaatt；
9、（5）crispr反应mix：lwacas13a 蛋白、depc 水、rnase 抑制剂、t7聚合酶、crrna、ssrna报告分子、dntps、rntps、mgcl2、tris (ph 7.4)；
10、（6）crrna：gauuuagacuaccccaaaaacgaaggggacuaaaactggtaagttcgacgataactcatacaaa；
11、（7）ssrna：
12、荧光报告分子：/fam/rururururu/iowa black quencher/；
13、侧流层析报告分子/fam/mararurgrgrcmamararurgrgrcma/bio/；荧光报告分子中接近5’端的dt用fam标记，接近3’端的dt用bhq1标记；侧流层析报告分子5’端的dt用fam标记，接近3’端的dt用生物素标记；
14、（8）阴性对照为双蒸水；
15、（9）阳性对照为溶藻弧菌基因组dna。
16、本专利技术还提供一种利用上述试剂盒检测溶藻弧菌核酸的检测方法，包括以下步骤：
17、（1）基因组dna提取：利用相应的核酸提取方法或者基因组提取试剂盒对患者血液完成基因组dna的提取。
18、（2）引物设计： 从genebank下载溶藻弧菌核酸序列，选择溶藻弧菌保守的gyrb区段，设计合成rpa引物及crrna。
19、rpa反应引物及crrna：
20、f1：gaaattaatacgactcactatagggggatatggccaccacgatgaatcgttag本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种溶藻弧菌核酸检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：
2.一种利用权利要求1所述试剂盒检测溶藻弧菌核酸的方法，包括以下步骤：
【技术特征摘要】
1.一种溶藻弧菌核酸检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：
【专利技术属性】
技术研发人员：陈昌国，王亚楠，刘新萍，侯雅超，齐永志，
申请(专利权)人：中国人民解放军总医院第六医学中心，
类型：发明
国别省市：
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