【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物，具体涉及一种人胎膜细胞外基质外泌体快速提取试剂盒、提取方法、组织外泌体悬液及应用。
技术介绍
1、外泌体是细胞通过特定的分泌途径释放到外部的纳米级囊泡，其大小通常介于30-150纳米。这些囊泡的形成与细胞的内质网、高尔基体有关，但主要与内突囊的成熟和多囊体的融合过程密切相关。外泌体中包含的生物分子，如蛋白质、脂质、rna和某些情况下的dna，使其在细胞间的信息传递中扮演关键角色。外泌体可以调控细胞功能，参与免疫应答，并在多种疾病的病理过程中，如癌症和神经性疾病中，发挥作用。绝大多数细胞，包括免疫细胞、肿瘤细胞和神经细胞，都有能力产生外泌体，且其可以在血液、尿液和唾液中被检测。此外，干细胞来源的外泌体在损伤修复中发挥关键作用，这是因为外泌体中所含有的多种生物活性分子可以促进损伤组织的修复和再生。
2、细胞外基质(ecm)是构成组织的基础框架，它为细胞提供支撑并促进细胞间的信号传导。外泌体在ecm中具有多重功能：它们促进细胞间的通信、参与组织再生和修复，并调节ecm的结构和功能。其异常的调控可能导致疾病的发展，例如通过改变ecm的组成或结构来影响肿瘤的生长和扩散。此外，外泌体在细胞的免疫应答中也起到了核心作用。因此，深入研究组织中的外泌体，特别是细胞外基质中的外泌体，对于揭示其在疾病中的角色至关重要。但值得注意的是，当前提取组织中的外泌体的技术仍面临挑战，如细胞破碎造成的非特异性囊泡的污染，以及在离体培养中可能产生的非生理状态的外泌体。
3、在人体内，不同组织器官的细胞外基质成分存在差异。
4、胎膜是包裹在胎儿周围的一层薄膜，对胎儿起到保护和营养供应的作用。它由两部分组成：靠近胎儿的羊膜和靠近母体的绒毛膜。胎膜中的细胞外基质是一个复杂的蛋白质网络，起到支撑和连接细胞的功能。其主要成分包括胶原蛋白、弹性蛋白、纤维连接蛋白、蛋白多糖如透明质酸以及多种细胞附着蛋白如纤维粘附蛋白和层粘连蛋白。这些蛋白质结构为胎膜提供了弹性和韧性，确保胎儿在子宫内有一个稳定和保护的环境。此外，胎膜中的细胞外基质也参与多种生物学过程，包括细胞增殖、分化、迁移以及信号传导，这些过程在妊娠期间和分娩时起到关键作用。已有研究报道脱细胞胎膜，尤其是脱细胞羊膜，可促进眼角膜、口腔黏膜和皮肤组织的损伤修复，这可能与其中存在的外泌体有关，尤其是细胞外机制外泌体。
5、现有技术中，已经出现了不少的组织外泌体的提取方法，比如肿瘤组织外泌体分离方法，皮肤、胰腺、神经组织外泌体分离方法。一般情况下，组织外泌体提取方法是采用特定的酶溶液，使得到的外泌体只源于组织细胞外基质，真实地反应出组织的病生理状况。
6、但目前尚未发现有人胎膜组织细胞外基质外泌体提取的试剂盒的报道。也正基于此，提出本专利技术技术方案。
技术实现思路
1、为了解决现有技术存在的问题，本专利技术的方案是提供一种人胎膜细胞外基质外泌体快速提取试剂盒，其包括如下组分：酶i、混合酶和d-hbss平衡盐溶液；其中：
2、所述酶i为中性蛋白酶；
3、所述混合酶为iv型胶原蛋白水解酶、中性蛋白酶和脱氧核糖核酸酶i。
4、为便于理解本专利技术，对相关成分进行说明：
5、中性蛋白酶：该酶在中性ph条件下展现出最佳的酶活性，能够催化多种蛋白质的分解反应。由于其广泛的底物特异性，它在食品工业和生物
得到了广泛应用，主要用于蛋白质的水解过程和质地的优化调整。
6、胶原蛋白水解酶：具有对胶原蛋白肽键的特异性水解功能，而不破坏其他类型的组织蛋白。这使得它在处理富含胶原的组织，例如皮肤和结直肠时，成为首选。胎膜中也含有大量的胶原。值得注意的是，胶原酶分为六个亚型，从胶原酶ⅰ到胶原酶iv。此外，胶原酶作为一种专门分解结缔组织中胶原蛋白的蛋白酶，在细胞分离、组织工程和某些医学治疗中都有广泛应用。
7、脱氧核糖核酸酶i（dna酶i，dnase i）：是一种核酸酶，专门切割dna链。在生物实验中，其主要用途是清除dna杂质，从而提高样本的纯度。当组织处理过程中发生细胞破裂，dna的释放可能导致样本粘稠度增加，进一步增强对细胞的机械应力，致使更多细胞破碎。通过加入dnase i，可以有效地降解游离的dna，优化细胞分离效果，并有助于维持细胞的完整性和活性，减少细胞内泌体的非特异性释放。
8、优选地，在酶i中，中性蛋白酶的浓度为2.2~2.6u/ml；
9、在混合酶中，iv型胶原蛋白水解酶的浓度为2.8~3.2mg/ml，中性蛋白酶的浓度为2.2~2.6u/ml，脱氧核糖核酸酶i的浓度为23~27μg/ml。
10、优选地，在酶i中，中性蛋白酶的浓度为2.4u/ml；
11、在混合酶中，iv型胶原蛋白水解酶的浓度为3mg/ml，中性蛋白酶的浓度为2.4u/ml，脱氧核糖核酸酶i的浓度为25μg/ml。
12、基于相同的技术构思，本专利技术的再一方案是提供一种人胎膜细胞外基质外泌体快速提取方法，其采用所述人胎膜细胞外基质外泌体快速提取试剂盒，所述快速提取方法包括如下步骤：
13、（i）预处理：
14、（1）将娩出的胎膜-蜕膜组织转移至d-hbss平衡盐溶液中，在不损坏羊膜-绒毛膜组织的情况下，除血块及蜕膜组织，得到胎膜全层组织；
15、（2）将所述胎膜全层组织以d-hbss平衡盐溶液进行清洗，得到干净胎膜全层组织；
16、（ii）胎膜组织外泌体提取：
17、（s1）将所述干净胎膜全层组织置于离心管中，并加入酶i溶液进行孵育，完成后离心，得到第一上清液和第一沉淀组织；
18、（s2）向所述第一沉淀组织加入混合酶溶液进行孵育，完成后再加入d-hbss平衡盐溶液，之后离心得到第二上清液；
19、（s3）将所述第一上清液与所述第二上清液混合，继续离心以去除细胞碎片，得到第三上清液；
20、（s4）将所述第三上清液过滤后再进行两次离心，弃上清，得到第二沉淀组织；
21、（s5）向所述第二沉淀组织加入无菌的d-hbss溶液进行离心，弃上清，得到第三沉淀组织；
22、（s6）向所述第三沉淀组织加入dpbs对沉淀进行溶解，得到组织外泌体悬液，提取完毕。
23、优选地，步骤（s1）中，所述孵育的温度为36~38℃，孵育的时间为18~22min；所述离心的条件为：380~420g，4~6min。
24、优选地，步骤（s2）中，所述孵育的温度为36~38℃，孵育的时间为85~95min；所述离心的条件为：380~420g，4~6min。
25、优选地，步骤（s3）中，离心共进行两次，第一次的本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种人胎膜细胞外基质外泌体快速提取试剂盒，其特征在于，包括如下组分：酶I、混合酶和D-HBSS平衡盐溶液；其中：
2.根据权利要求1所述的一种人胎膜细胞外基质外泌体快速提取试剂盒，其特征在于，在酶I中，中性蛋白酶的浓度为2.2~2.6U/mL；
3.根据权利要求2所述的一种人胎膜细胞外基质外泌体快速提取试剂盒，其特征在于，在酶I中，中性蛋白酶的浓度为2.4U/mL；
4.一种人胎膜细胞外基质外泌体快速提取方法，其特征在于，采用所述人胎膜细胞外基质外泌体快速提取试剂盒，所述快速提取方法包括如下步骤：
5.根据权利要求4所述的一种人胎膜细胞外基质外泌体快速提取方法，其特征在于，步骤（S1）中，所述孵育的温度为36~38℃，孵育的时间为18~22min；所述离心的条件为：380~420g，4~6min。
6.根据权利要求4所述的一种人胎膜细胞外基质外泌体快速提取方法，其特征在于，步骤（S2）中，所述孵育的温度为36~38℃，孵育的时间为85~95min；所述离心的条件为：380~420g，4~6min。
7.根
8.根据权利要求4所述的一种人胎膜细胞外基质外泌体快速提取方法，其特征在于，步骤（S4）中，过滤的孔径为0.22μm；第一次的离心条件为：9000~11000g，28~32min；第二次的离心条件为：98000~120000g，65~75min，3~5℃；
9.权利要求4~8任一项所述一种人胎膜细胞外基质外泌体快速提取方法得到的组织外泌体悬液。
10.权利要求9所述组织外泌体悬液在多组学测序、再生医学、精准医学中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种人胎膜细胞外基质外泌体快速提取试剂盒，其特征在于，包括如下组分：酶i、混合酶和d-hbss平衡盐溶液；其中：
2.根据权利要求1所述的一种人胎膜细胞外基质外泌体快速提取试剂盒，其特征在于，在酶i中，中性蛋白酶的浓度为2.2~2.6u/ml；
3.根据权利要求2所述的一种人胎膜细胞外基质外泌体快速提取试剂盒，其特征在于，在酶i中，中性蛋白酶的浓度为2.4u/ml；
4.一种人胎膜细胞外基质外泌体快速提取方法，其特征在于，采用所述人胎膜细胞外基质外泌体快速提取试剂盒，所述快速提取方法包括如下步骤：
5.根据权利要求4所述的一种人胎膜细胞外基质外泌体快速提取方法，其特征在于，步骤（s1）中，所述孵育的温度为36~38℃，孵育的时间为18~22min；所述离心的条件为：380~420g，4~6min。
6.根据权利要求4所述的一种人胎膜细胞外基质外泌体快速提取方法，...
【专利技术属性】
技术研发人员：曹家松，林启妹，申永梅，王奕欣，常颖，王舒琪，余静，刘甄，
申请(专利权)人：优智嘉天津生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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