System.ArgumentOutOfRangeException: 索引和长度必须引用该字符串内的位置。 参数名: length 在 System.String.Substring(Int32 startIndex, Int32 length) 在 zhuanliShow.Bind()
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物检测,具体地说涉及一种大肠杆菌总rna残留检测试剂盒及其检测方法和应用。
技术介绍
1、天然质粒是细菌、酵母菌和放线菌等生物中染色体(或拟核)以外的dna分子,存在于细胞质中,具有自主复制能力,使其在子代细胞中也能保持恒定的拷贝数,并表达所携带的遗传信息。质粒本身可以携带外源目的基因用于质粒dna基因治疗药物的开发,也是car-t、mrna等细胞与基因治疗药物的基本原料,而且随科学技术的发展,质粒在医药、农业和环保、食品等领域都有了广泛应用,特别是在细胞基因治疗、mrna疫苗等先进疗法药物技术中。质粒可以作为dna疫苗产品或产品的主要成分之一,同时也可作为病毒载体或dna载体基因疗法的重要原料,病毒载体或非病毒载体细胞免疫疗法的重要原料。这些dna产品的rna残留可能影响其生物学活性(如干扰质粒的转染、表达效率)或造成风险(如外源rna可激活细胞干扰素通路引发免疫反应),因此需建立dna产品的rna残留定量检测方法。
2、质粒的工业化生产是通过大肠杆菌发酵、碱裂解、纯化获得质粒产品,碱裂解时大肠杆菌中大量的rna也会同时释放出来并随机断裂形成大小不一的rna碎片。目前针对质粒样本中总rna残留检测有多种方法,如紫外分光光度法、琼脂糖凝胶电泳法和rt-qpcr法。使用紫外分光光度法检测质粒dna产品溶液的od260与od280之比可粗略检测是否存在rna残留,但该方法受蛋白残留、rna碎片大小等因素的影响,因此实际应用中该方法对rna残留的灵敏度与准确性较差。目前常用的检测方法是琼脂糖凝胶电泳(age
3、age法仅仅可进行定性检测,常用的age核酸染料对rna的灵敏性远低于dna,样品中dna成分会严重影响rna曝光成像,而且实际rna残留为rna降解碎片而非完整的rna,这些进一步降低了age法的灵敏性和准确性。
4、相比age法,逆转录荧光定量pcr(rt-qpcr)法的灵敏度和准确度都是提升一个量级。一般的rt-qpcr法,实验流程复杂,包括样本处理、逆转录、pcr反应等。且样本处理等较复杂,对检测结果的影响比较大。因此,本细分领域亟需研发一种准确、简便的质粒dna产品中rna残留检测方法或者检测试剂盒用于医药质量监控。基于rt-qpcr法检测质粒rna含量的不可控因素在于质粒样本处理环节,一般经过酶消化dna后再进行检测。但是由于提取rna步骤繁琐,会导致rna提取回收率不可控,严重影响了检测的准确性。常规的酶消化过程中由于酶的用量、酶的特性、酶反应时间均对最终检测结果的回收率造成影响。
技术实现思路
1、专利技术目的:本专利技术的目的是提供一种以大肠杆菌16srna基因为标签建立的用于检测大肠杆菌总rna残留的试剂盒;本专利技术还有一个目的是提供所述试剂盒在定量检测大肠杆菌总rna残留上的应用;本专利技术还有一个目的是提供一种经消化处理后直接对质粒样本进行rt-qpcr检测以确定大肠杆菌总rna残留的方法。
2、技术方案:为了实现上述专利技术目的,本专利技术的一种大肠杆菌总rna残留检测试剂盒,包括如seq id no:1所示的上游引物、如seq id no:2所示的下游引物、如seq id no:3所示的引物探针、稀释液、逆转录酶、enzyme mix和rna定量参考品。
3、其中,所述enzyme mix为pcr反应用dna聚合酶混合物,包括tag dna聚合酶和dntps。
4、进一步地,所述rna定量参考品来源于大肠杆菌总rna提取物。
5、进一步地,所述大肠杆菌总rna残留检测试剂盒还包括前处理体系,所述前处理体系包括dna酶和质控品,所述质控品包含大肠杆菌dna、大肠杆菌rna和质粒dna。
6、本专利技术基于rt-qpcr技术,以16srna基因为标签建立直接进行rt-qpcr检测的方法;特别是利用前处理体系的酶消化体系,结合rt-pcr法检测质粒样本rna残留,具有较好的方法学性能。
7、其中,所述上游引物、下游引物、引物探针、逆转录酶,以及必要的逆转录buffer可预混合装入一个独立容器中作为probe mix。也可必要地将该probe mix通过冷冻干燥工艺制成相应产品,以提高产品稳定性并延长产品保质期。
8、优选地,所述试剂盒还包括消化反应液,所述消化反应液包括rna酶抑制剂和反应buffer。
9、优选地,所述dna酶为dnasei。所述dna酶优选使用不含有或极少含有残留蛋白酶产品。
10、进一步地,为保证dna酶消化彻底做质控对照,所述质控品中的大肠杆菌dna含量为0.1-1wt%;为保障酶消化过程中对rna样品额外的痕量损失做质控对照,所述大肠杆菌rna的含量为5-20pg/μl,优选的含量为20pg/μl;为模拟真实样本提供高浓度核酸背景做质控对照,所述质粒dna的含量为0.5-1mg/ml,优选的含量为1mg/ml。
11、前述的大肠杆菌总rna残留检测试剂盒可用于包括但不限于生物医药行业中用于生产的质粒样本中大肠杆菌总rna残留的检测。前述的前处理试剂可独立成为一个产品,也可包含在大肠杆菌总rna残留检测试剂盒中。
12、本专利技术还提供了基于前述试剂盒检测大肠杆菌总rna残留的方法,该方法包括如下步骤:
13、(1)分别对质粒样本和质控品进行消化处理;
14、(2)消化后直接将消化处理获得的混合物进行rt-qpcr检测。
15、其中,所述消化处理是向质粒样本中加入2-8u/μgdna的dna酶,依次在37℃反应15-25min,在90℃反应8-15min,并保存在2-8℃下备用。
16、进一步地,以所述质控品的回收率在70-130%之间内作为质控标准。相较于美国药典第509号通则(usp<509>)发布的关于qpcr检测准确性回收率50-150%的参考标准而言,本专利技术提供的质控标准严于美国药典。而本专利技术提供的试剂盒及其前处理体系使得该标准的实现具有可行性。
17、有益效果:(1)本专利技术提供的前处理体系及相应的检测方法,在做样本消化的同时增加酶消化质控,通过消化质控品控制消化的过程,排除酶消化过程对检测结果的影响;同时对不同引物表现出更好的兼容性。(2)本专利技术基于前处理和特定的引物探针和反应体系,对大肠杆菌总rna残留的检测经验证具有优秀的专属性、准确度、灵敏度和精密度。
本文档来自技高网...【技术保护点】
1.一种大肠杆菌总RNA残留检测试剂盒,其特征在于:包括如SEQ ID NO:1所示的上游引物、如SEQ ID NO:2所示的下游引物、如SEQ ID NO:3所示的引物探针、稀释液、逆转录酶、Enzyme Mix和RNA定量参考品。
2.根据权利要求1所述的一种大肠杆菌总RNA残留检测试剂盒,其特征在于:所述RNA定量参考品来源于大肠杆菌总RNA提取物。
3.根据权利要求1或2所述的一种大肠杆菌总RNA残留检测试剂盒,其特征在于:该试剂盒还包括前处理体系,所述前处理体系包括DNA酶和质控品,所述质控品包含大肠杆菌DNA、大肠杆菌RNA和质粒DNA。
4.根据权利要求3所述的一种大肠杆菌总RNA残留检测试剂盒,其特征在于:所述前处理体系还包括消化反应液,所述消化反应液包括RNA酶抑制剂和反应buffer。
5.根据权利要求4所述的一种大肠杆菌总RNA残留检测试剂盒,其特征在于:所述DNA酶为DNaseI。
6.根据权利要求4或5所述的试剂盒,其特征在于:所述质控品中的大肠杆菌DNA含量为0.1-1wt%,大肠杆菌RNA含
7.如权利要求1-6任意一项所述的试剂盒在定量检测大肠杆菌总RNA残留上的应用。
8.利用权利要求1所述试剂盒检测大肠杆菌总RNA残留的方法,其特征在于:
9.根据权利要求8所述的方法,其特征在于:所述消化处理是向质粒样本中加入2-8U/μgDNA的DNA酶,依次在37℃反应15-25min,在90℃反应8-15min。
10.根据权利要求8或9所述的方法,其特征在于:以所述质控品的回收率在70-130%之间内作为质控标准。
...【技术特征摘要】
1.一种大肠杆菌总rna残留检测试剂盒,其特征在于:包括如seq id no:1所示的上游引物、如seq id no:2所示的下游引物、如seq id no:3所示的引物探针、稀释液、逆转录酶、enzyme mix和rna定量参考品。
2.根据权利要求1所述的一种大肠杆菌总rna残留检测试剂盒,其特征在于:所述rna定量参考品来源于大肠杆菌总rna提取物。
3.根据权利要求1或2所述的一种大肠杆菌总rna残留检测试剂盒,其特征在于:该试剂盒还包括前处理体系,所述前处理体系包括dna酶和质控品,所述质控品包含大肠杆菌dna、大肠杆菌rna和质粒dna。
4.根据权利要求3所述的一种大肠杆菌总rna残留检测试剂盒,其特征在于:所述前处理体系还包括消化反应液,所述消化反应液包括rna酶抑制剂和反应buffer。
5....
【专利技术属性】
技术研发人员:郭彦飞,钱依纯,许蓓,
申请(专利权)人:浙江健新原力制药有限公司,
类型:发明
国别省市:
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。