【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物检测领域，具体的说，涉及一种用于检测抗cd22的单克隆抗体的活性的方法及其应用。
技术介绍
1、cd22是bcr的共受体，通过能够区分病原体(“非自身”)或表达2,6-连接唾液酸配体的自体(“自身”)细胞上的抗原来调节有害的自身抗原信号转导，其中cd22将与2,6-连接唾液酸配体结合并调节有害的bcr信号转导(nitschke et al.,1997,cornall et al.,1999,kawasaki et al.,2011)。cd22先前被证明存在于事先形成同源多聚体的纳米团簇中，其形成依赖于相邻cd22分子与2,6-连接唾液酸配体的顺式结合(gasparrini et al.,2016)。cd22纳米团簇被覆盖从而限制bcr的调节。另一方面，当自体细胞(自身)上的自身抗原与bcr结合时，cd22优先与自体细胞的α2，6-连接唾液酸配体反式结合，增加b细胞活化的免疫调节，从而导致对自身抗原的免疫耐受(courtney et al.,2009,pfrengle et al.,2013,lübbers et al.,2018,kishimoto and maldonado,2018)。b细胞上cd22的顺式配体和反式配体结合之间的平衡发生偏移将影响cd22的免疫调节功能，导致自身免疫反应发生。事实上，通过损伤唾液酸o-乙酰酯酶(siae)，使得cd22与唾液酸的结合失调，与自身免疫性障碍有关(surolia et al.,2010)。而且，siae缺失的转基因小鼠容易发生sle样自身免疫性疾病，突出了cd2
2、sm03是一种重组人cd22单克隆抗体注射液，于2006年8月首次获得cde批准开展临床试验，目前已被cde批准在非霍奇金氏淋巴瘤、系统性红斑狼疮和类风湿关节炎中开展临床试验。药理学研究发现，其能够高选择特异性的与人b细胞表面的cd22结合。
3、经人源化改造的sm03单抗被命名为sm06。sm03和sm06针对人cd22抗原上的同一个位点，且具有类似的亲和力。然而，在氨基酸序列和结构上，sm03和sm06只有抗原识别部位相同，这一相同部分由它们各自的互补决定区(cdr)序列构成。sm03和sm06都能特异性识别吸附人cd22抗原，而且结合后抗体-抗原复合体会发生明显的内化。这一特性使得对sm03和sm06单抗产品的生物活性检测变得十分困难。
4、sm03在体内可诱导恒河猴和食蟹猴特征性的外周血cd22+b细胞清除效应。安全药理学研究发现，sm03对呼吸系统、心血管系统及中枢神经系统均无影响。通过一系列体内外药代动力学研究表征sm03的药代动力学特征；并在相关种属食蟹猴中进行了单次及重复给药毒性研究，另外，还进行了组织交叉研究、体外溶血研究表征sm03的毒性特征。上述研究结果表明，sm03靶点明确，具有潜在治疗自身免疫性疾病的药效，且具有较好的药代特征及安全性。
5、cd22抗原为b细胞系限制性分化抗原，存在于分化成熟的b-细胞表面，作为抑制性受体，参与b细胞内及b细胞介导信号通路的功能性调节。sm03等单抗能够识别并吸附cd22抗原，理论上，sm03等单抗通过吸附成熟b细胞表面所表达的cd22抗原，参与调控b细胞介导的免疫反应，或改变b细胞本身的分化增殖特性，影响其下游的细胞信号通路。sm03对b细胞致炎性免疫产生抑制的作用机理尚未明确证实，申请人进行的拓展性研究显示，sm03是一种抗cd22的重组igg1单克隆抗体，申请人提出sm03作为系统性自身免疫性疾病治疗药物的成功是通过利用sm03全新独特的作用机制。cd22是bcr的抑制性共受体，是抗自身免疫性疾病潜在的免疫治疗靶点。sm03通过干扰cd22与α2，6-连接唾液酸的顺式结合，干扰cd22同源多聚体构象，诱导cd22从人b细胞表面快速内化，并促进cd22与人自体细胞的反式结合。这导致增加了下游免疫调节分子src同源区2结构域的磷酸酶1(shp-1)的活性，结果降低了bcr诱导的人b细胞nf-κb活化和b细胞增殖(wong et al.,2022)。该作用机制为支持临床试验中疾病的显著改善和良好的安全性提供了理论依据，如通过cd22反式结合自体细胞上的α2,6-唾液酸配体的“自身”识别机制，sm03特异性地恢复b细胞对宿主组织的免疫耐受，而不影响正常b细胞对病原体的免疫反应能力。
6、针对sm03等抗cd22的单克隆抗体与cd22结合之后会随着cd22一起被内吞至细胞内部的特性，本领域急需开发一项针对抗cd22的单克隆抗体内吞的活性检测方法。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于，提供一种用于检测抗cd22的单克隆抗体的活性的方法及其应用。
2、本专利技术提供一种用于检测抗cd22的单克隆抗体的活性的方法，将待测抗cd22的单克隆抗体与ramos细胞共孵育，检测内吞的待测抗cd22的单克隆抗体的浓度，将内吞的待测抗cd22的单克隆抗体的浓度与待测抗cd22的单克隆抗体的原始浓度相比，得到待测抗cd22的单克隆抗体的活性。
3、其中，所述的用于检测抗cd22的单克隆抗体的活性的方法，其特征在于，所述抗cd22的单克隆抗体为单克隆抗体sm03或单克隆抗体sm06。
4、其中，所述检测内吞的待测抗cd22的单克隆抗体的浓度的方法包括如下步骤：
5、1)将待测样品与ramos细胞共孵育并诱导内吞；
6、2)将步骤1)中培养的细胞酸洗以去除剩余的表面结合抗体，然后固定；
7、3)将步骤2)固定后的细胞培养物中加入通透液以封闭并透化；
8、4)向步骤3)中透化好的细胞中加入具有hrp偶联物的抗igg抗体的封闭液进行探测；
9、5)加入tmb和终止溶液，检测内吞的的待测抗cd22的单克隆抗体的浓度。
10、其中，所述步骤1)中的诱导温度为37℃，诱导时间为1小时；所述步骤1)中酸洗的酸洗使用的酸洗液的为甘氨酸、氯化钠的水溶液，配置方法为称取0.75g甘氨酸、0.44g氯化钠，溶于50ml超纯水中，ph调至3.0。
11、其中，所述步骤2)中固定使用的固定液为4％多聚甲醛溶液；固定时间为10min。
12、其中，所述步骤3)中使用的通透液为用1×pbs配制1％bsa溶液0.1％triton-x100溶液，2～8℃保存；所述封闭并透化的时间为1小时。
13、其中，所述步骤4)中的hrp偶联物的抗igg抗体在封闭液中的稀释比例为1:5000(体积比)；
14、所述步骤4)中的封闭液为用1×pbs配制1％bsa溶液；
15、所述探测时间为1小时。
16、其中，所述步骤5)中检测内吞的的待测抗cd2本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种用于检测抗CD22的单克隆抗体的活性的方法，其特征在于，包括将待测抗CD22的单克隆抗体与RAMOS细胞共孵育，检测内吞的待测抗CD22的单克隆抗体的浓度，将内吞的待测抗CD22的单克隆抗体的浓度与待测抗CD22的单克隆抗体的原始浓度相比，得到待测抗CD22的单克隆抗体的活性的步骤。
2.根据权利要求1所述的用于检测抗CD22的单克隆抗体的活性的方法，其特征在于，所述检测内吞的待测抗CD22的单克隆抗体的浓度的方法包括如下步骤：
3.根据权利要求2所述的用于检测抗CD22的单克隆抗体的活性的方法，其特征在于，所述步骤1)中的诱导温度为37℃，诱导时间为1小时；所述步骤1)中酸洗的酸洗使用的酸洗液的为甘氨酸、氯化钠的水溶液。
4.根据权利要求2所述的用于检测抗CD22的单克隆抗体的活性的方法，其特征在于，所述步骤2)中固定使用的固定液为4％多聚甲醛溶液；室温静置固定10分钟。
5.根据权利要求2所述的用于检测抗CD22的单克隆抗体的活性的方法，其特征在于，所述步骤3)中使用的通透液为用1×PBS配制1％BSA溶液0.1％Tri
6.根据权利要求2所述的用于检测抗CD22的单克隆抗体的活性的方法，其特征在于，所述步骤4)中的HRP偶联物的抗IgG抗体在封闭液中的稀释比例为1:5000；所述探测时间为1小时。
7.根据权利要求2所述的用于检测抗CD22的单克隆抗体的活性的方法，其特征在于，所述步骤5)中检测内吞的的待测抗CD22的单克隆抗体的浓度的方法为，检测加入TMB和终止溶液后的细胞培养液的OD值，并将其与活性为100％的抗CD22的单克隆抗体的标准曲线相比较，得到，检测内吞的的待测抗CD22的单克隆抗体的浓度。
8.根据权利要求2所述的用于检测抗CD22的单克隆抗体的活性的方法，其特征在于，所述步骤5)中的终止液为硫酸溶液。
9.根据权利要求1-8任一所述的用于检测抗CD22的单克隆抗体的活性的方法，其特征在于，所述抗CD22的单克隆抗体为单克隆抗体SM03或单克隆抗体SM06。
10.权利要求1-9任一所述的用于检测抗CD22的单克隆抗体的活性的方法在制备含有抗CD22的单克隆抗体的药物中的应用。
...【技术特征摘要】
1.一种用于检测抗cd22的单克隆抗体的活性的方法，其特征在于，包括将待测抗cd22的单克隆抗体与ramos细胞共孵育，检测内吞的待测抗cd22的单克隆抗体的浓度，将内吞的待测抗cd22的单克隆抗体的浓度与待测抗cd22的单克隆抗体的原始浓度相比，得到待测抗cd22的单克隆抗体的活性的步骤。
2.根据权利要求1所述的用于检测抗cd22的单克隆抗体的活性的方法，其特征在于，所述检测内吞的待测抗cd22的单克隆抗体的浓度的方法包括如下步骤：
3.根据权利要求2所述的用于检测抗cd22的单克隆抗体的活性的方法，其特征在于，所述步骤1)中的诱导温度为37℃，诱导时间为1小时；所述步骤1)中酸洗的酸洗使用的酸洗液的为甘氨酸、氯化钠的水溶液。
4.根据权利要求2所述的用于检测抗cd22的单克隆抗体的活性的方法，其特征在于，所述步骤2)中固定使用的固定液为4％多聚甲醛溶液；室温静置固定10分钟。
5.根据权利要求2所述的用于检测抗cd22的单克隆抗体的活性的方法，其特征在于，所述步骤3)中使用的通透液为用1×pbs配制1％bsa溶液0.1％triton-x 1...
【专利技术属性】
技术研发人员：黄健乐，庄智豪，
申请(专利权)人：海南赛乐敏生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。