【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及使用荧光偏振(fp)确定样品中分析物的存在。具体地，本专利技术涉及使用荧光染料和fp检测样品中的非单体形成。
技术介绍
1、治疗性蛋白在制造过程中的聚集对产品的成功生产具有显著风险。这是由于高分子量物质(hmws)(即，不是单体的igg分子)的形成。
2、已知聚集体潜在地影响治疗物的安全性并且因此在制造过程中被视为“关键质量属性”(cqa)。在从细胞培养到纯化到药物配制的生产过程中，聚集可能潜在地在许多阶段发生。因此，快速且经济地测量聚集体的能力是重要的。
3、测量聚集体的经典黄金标准方法是通过高效液相色谱(hplc)体积排除色谱法(sec)。然而，尽管其有准确度，但其通量低并且需要高度训练有素的人员。
4、存在几种基于染料的方法来测量聚集水平，诸如sypro orange、硫磺素t和可商购的(enzo life sciences，埃克塞特，英国)，它们能够通过测量荧光来实现聚集体的高通量定量。然而，当测量低百分比的天然存在的聚集体时，这些方法的准确度差。
5、由sheun oshinbolu等人(journal of chemical technology andbiotechnology.vol.93(3),pp.909-917(2018))发表的工作描述了通过使用聚集结合荧光团来测量蛋白质聚集。然而，这项研究是使用通过热变性产生的非天然聚集体进行的。使用天然存在的聚集体时，这些染料的性能差。另外，可商购的基于荧光团的方法在天然和非天然聚集体的低水平聚集时准确度差
6、本专利技术的目的是克服上面提到的问题中的至少一个。
技术实现思路
1、申请人已经发现，荧光团分子二氮杂氧杂三角烯鎓(diazaoxatriangulenium)的衍生物(daota-式(i)和(iii))诸如二氮杂氧杂三角烯鎓的n'-丙基,n-丙基衍生物(n’pnp-daota；式(ii))与细胞培养基中的非单体igg结合，并且可以使用荧光偏振(fp)以高灵敏度测量这种结合。因此，此方法可以用于定量细胞培养上清液中非单体(或其他分析物)的水平。
2、
3、其中r独立地选自氢、c1-c6烷基、c2-c6烯基、c2-c6炔基、苯基、c4-c8环烷基、c1-c6氨基烷基、c1-c6亚烷基磺酸酯、c1-c18烷基、c1-c22烷基、亚甲基磺酸酯、亚乙基磺酸酯、c1-c6烷基磺酰基、三氟甲基、氨基、氨基羰基、氨基硫代羰基、氨基羰基氨基、氨基硫代羰基氨基、氨基羰基氧基、氨基磺酰基、氨基磺酰基氧基、氨基磺酰基氨基、脒基、羧基、羧基酯、(羧基酯)氨基、(羧基酯)氧基、磺酰基、磺酰基氧基、硫代酰基、硫醇、硫代羰基、c1-c6-烷硫基、杂芳基、环烷基、苯基、羟基苯基、氨基苯基、氨基-c1-c6-烷基、杂环基、聚乙二醇、羧酸、烷基卤、丙烯酰胺、羧酸的活化酯、羟基、醛、磺酸酯、胺、抗原、酸酐、苯胺、芳基卤、叠氮化物、氮杂环丙烷、硼酸酯、碳二亚胺、重氮烷、环氧化物、二醇、卤代乙酰胺、卤代三嗪、肼、羟基胺、酰亚胺基酯、异氰酸酯、异硫氰酸酯、酮、马来酰亚胺、亚磷酰胺、磺酰基卤、硫醇基团、酪酸和丁酸。
4、
5、根据所附权利要求，提供了向感兴趣的抗体样品中添加上述荧光团并且使用荧光偏振测量聚集体结合程度的方法。样品聚集程度的定量可以通过从已知聚集程度的标准曲线进行插值来确定。
6、提供了用于测量液体样品中蛋白质或多肽的聚集程度的方法，所述方法包括以下步骤：
7、将一定量的荧光团分子添加至包含聚集的蛋白质或多肽的所述液体样品中；
8、测量所述液体样品的荧光偏振值；
9、以及将所述液体样品的测量荧光偏振值与参考荧光偏振值进行比较以确定所述液体样品中所述蛋白质或所述多肽的聚集程度；
10、其中所述荧光团分子是式(i)的二氮杂氧杂三角烯鎓或其衍生物；
11、
12、并且
13、其中r独立地选自氢、c1-c6烷基、c2-c6烯基、c2-c6炔基、苯基、c4-c8环烷基、c1-c6氨基烷基、c1-c6亚烷基磺酸酯、c1-c18烷基、c1-c22烷基、亚甲基磺酸酯、亚乙基磺酸酯、c1-c6烷基磺酰基、三氟甲基、氨基、氨基羰基、氨基硫代羰基、氨基羰基氨基、氨基硫代羰基氨基、氨基羰基氧基、氨基磺酰基、氨基磺酰基氧基、氨基磺酰基氨基、脒基、羧基、羧基酯、(羧基酯)氨基、(羧基酯)氧基、磺酰基、磺酰基氧基、硫代酰基、硫醇、硫代羰基、c1-c6-烷硫基、杂芳基、环烷基、苯基、羟基苯基、氨基苯基、氨基-c1-c6-烷基、杂环基、聚乙二醇、羧酸、烷基卤、丙烯酰胺、羧酸的活化酯、羟基、醛、磺酸酯、胺、抗原、酸酐、苯胺、芳基卤、叠氮化物、氮杂环丙烷、硼酸酯、碳二亚胺、重氮烷、环氧化物、二醇、卤代乙酰胺、卤代三嗪、肼、羟基胺、酰亚胺基酯、异氰酸酯、异硫氰酸酯、酮、马来酰亚胺、亚磷酰胺、磺酰基卤、硫醇基团、酪酸和丁酸。
14、在一方面，所述衍生物是下式的二氮杂氧杂三角烯鎓：
15、
16、在一方面，所述荧光团分子选自二氮杂氧杂三角烯鎓的n-丙基,n'-丙基衍生物。优选地，所述荧光团分子是二氮杂氧杂三角烯鎓的n-丙基,n'-丙基衍生物，如式(ii)所示
17、
18、在一方面，所述蛋白质或多肽选自抗体、抗体片段、酶、淀粉样蛋白。优选地，所述抗体选自igg、igm、ige、igd和iga。
19、在一方面，提供了确定样品中聚集分析物的存在的方法，所述方法包括：
20、使所述样品与式(i)的化合物或其衍生物接触，
21、
22、其中r独立地选自氢、c1-c6烷基、c2-c6烯基、c2-c6炔基、苯基、c4-c8环烷基、c1-c6氨基烷基、c1-c6亚烷基磺酸酯、c1-c18烷基、c1-c22烷基、亚甲基磺酸酯、亚乙基磺酸酯、c1-c6烷基磺酰基、三氟甲基、氨基、氨基羰基、氨基硫代羰基、氨基羰基氨基、氨基硫代羰基氨基、氨基羰基氧基、氨基磺酰基、氨基磺酰基氧基、氨基磺酰基氨基、脒基、羧基、羧基酯、(羧基酯)氨基、(羧基酯)氧基、磺酰基、磺酰基氧基、硫代酰基、硫醇、硫代羰基、c1-c6-烷硫基、杂芳基、环烷基、苯基、羟基苯基、氨基苯基、氨基-c1-c6-烷基、杂环基、聚乙二醇、羧酸、烷基卤、丙烯酰胺、羧酸的活化酯、羟基、醛、磺酸酯、胺、抗原、酸酐、苯胺、芳基卤、叠氮化物、氮杂环丙烷、硼酸酯、碳二亚胺、重氮烷、环氧化物、二醇、卤代乙酰胺、卤代三嗪、肼、羟基胺、酰亚胺基酯、异氰酸酯、异硫氰酸酯、酮、马来酰亚胺、亚磷酰胺、磺酰基卤、硫醇基团、酪酸和丁酸；
23、照射所述样品；
24、测量经照射样品的荧光偏振；以及
25、将所述经照射样品的荧光偏振值与参考荧光偏振值进行比较以确定所述样品中所述分析物的聚集程度。
26、在一方面，所述衍生物是式(iii)的二氮杂氧杂三角烯本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种用于测量液体样品中蛋白质或多肽的聚集程度的方法，所述方法包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述衍生物是下式的二氮杂氧杂三角烯鎓
3.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述荧光团分子选自二氮杂氧杂三角烯鎓的N-丙基,N'-丙基衍生物。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述荧光团分子是二氮杂氧杂三角烯鎓的N-丙基,N'-丙基衍生物，如式(II)所示
5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述蛋白质或多肽选自抗体、抗体片段、酶、淀粉样蛋白、Fc融合蛋白、抗凝剂、血液因子、骨形态发生蛋白、工程化蛋白支架、生长因子、激素、干扰素、白介素、血栓溶解剂、tau、α-突触核蛋白、TAR DNA结合蛋白43、C9orf72相关蛋白、胰岛淀粉样多肽和甲状腺素运载蛋白。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述抗体选自IgG、IgM、IgE、IgD和IgA。
7.一种确定样品中聚集分析物的存在的方法，所述方法包括：
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述衍生物是式(III)的二氮杂
9.根据权利要求7或权利要求8所述的方法，其中所述化合物是二氮杂氧杂三角烯鎓的N-丙基,N'-丙基衍生物。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述化合物是二氮杂氧杂三角烯鎓的N-丙基,N'-丙基衍生物，如式(II)所示
11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述分析物选自抗体、抗体片段、酶、淀粉样蛋白、Fc融合蛋白、抗凝剂、血液因子、骨形态发生蛋白、工程化蛋白支架、生长因子、激素、干扰素、白介素、血栓溶解剂、tau、α-突触核蛋白、TAR DNA结合蛋白43、C9orf72相关蛋白、胰岛淀粉样多肽和甲状腺素运载蛋白。
...【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】
1.一种用于测量液体样品中蛋白质或多肽的聚集程度的方法，所述方法包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述衍生物是下式的二氮杂氧杂三角烯鎓
3.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述荧光团分子选自二氮杂氧杂三角烯鎓的n-丙基,n'-丙基衍生物。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述荧光团分子是二氮杂氧杂三角烯鎓的n-丙基,n'-丙基衍生物，如式(ii)所示
5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述蛋白质或多肽选自抗体、抗体片段、酶、淀粉样蛋白、fc融合蛋白、抗凝剂、血液因子、骨形态发生蛋白、工程化蛋白支架、生长因子、激素、干扰素、白介素、血栓溶解剂、tau、α-突触核蛋白、tar dna结合蛋白43、c9orf72相关蛋白、胰岛淀粉样多肽和甲状腺素运载蛋白。
6.根据权利要求5所述的方法，...
【专利技术属性】
技术研发人员：B·汤普森，R·维尼奥勒，H·伯恩，
申请(专利权)人：瓦里泰细胞有限公司，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。