【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物检测分析，具体涉及一种基于分离的分段同源多糖组的多糖结构解析方法。
技术介绍
1、多糖 (polysaccharide)是由十个单糖通过糖苷键连接形成，构成生物的重要的大分子物质之一，被证明具有丰富的生物活性，包括免疫活性，抗糖尿病，抗癌，抗炎等。常见多糖结构如图12所示（以香菇多糖示例）（ankaj kumar, rishi paliwal, arvindgulbake,lentinan: an unexplored novel biomaterial in drug and gene deliveryapplications, journal of controlled release, 2023, volume 356, 316-336），多糖结构决定其活性，多糖结构与活性的关系是多糖应用快速发展的指导。明确多糖结构，一是研究多糖构效关系的基础，进而为多糖的应用提供依据；二是多糖药理学以及毒理学研究的基础，对于医学多糖应用具有里程碑式的意义。但是多糖解析目前仍存在较大困难，多糖结构复杂，它由十个及以上的单糖通过糖苷键连接形成，相对分子质量从几万到几千万不等，具有丰富的分支结构，并折叠形成不同的空间结构。由于单糖类型丰富，连接位置以及连接顺序的不同使得多糖结构复杂，导致多糖的组合可能性多，结构解析十分困难（叶立斌,张劲松,潘迎捷.食药用菌多糖结构解析中的核磁共振技术[j].食用菌学报,2007(04):68-75.doi:10.16488/j.cnki.1005-9873.2007.04.012.；刘玉红,
2、多糖结构解析的方法主要有四大类包括色谱法，质谱法，波谱法以及光谱法。波谱法中的核磁共振波谱法（nmr）是目前研究多糖结构的主流方法（杜秀菊,张劲松,潘迎捷.核磁共振技术在食用菌多糖结构分析中的作用[j].中国食用菌,2010,29(01):3-6+19.doi:10.13629/j.cnki.53-1054.2010.01.005.）。nmr能够得到较为全面的多糖结构信息，包括单糖组成，糖苷键，糖苷键连接顺序（刘玉红,王凤山.核磁共振波谱法在多糖结构分析中的应用[j].食品与药品,2007(08):39-43.）。目前常用于多糖结构解析的nmr的类型主要包括一维图谱，1h nmr谱，13c nmr谱，二维图谱包括hsqc谱、hmbc谱、cosy谱、noesy谱。一般来说，解析nmr图谱首先需要利用1h nmr谱，13c nmr谱获得简单的多糖结构信息，之后根据hsqc谱一一对应端基氢与端基碳，再利用cosy, noesy图谱从端基氢出发寻找其它位置的氢，等到氢全部归属完后，再利用hsqc谱归属所有的碳信号，最后利用hmbc、noesy验证归属的碳氢信号峰，并确认各个糖残基的连接位置和顺序。并结合单糖组成，糖苷键，分子量等信息便可解析多糖结构。
3、但是，现有技术利用nmr解析多糖结构的方法仍存在三个明显的问题：
4、（1）一次性只能解析一个多糖的结构：现有技术的方法一次性只能解析一个多糖的结构是指在一次nmr检测后得到一个多糖的各种nmr图谱，然后根据一个多糖的图谱分析这一个多糖的结构，如果要解析多个多糖的结构只能将每个多糖依次按照上述步骤分析，解析效率低，如李雪琴、张军银、曹长靓等人的研究中虽然文中有制备多个多糖，但在结构解析时均是利用一个多糖的甲基化分析、核磁共振波谱进行信号峰的归属分析，多个多糖之间的分析都是独立的、无相互比较分析；（李雪琴. 不同分子量柴胡多糖的结构解析及体外生物活性研究[d]. 山西:山西大学,2022.张军银. 多花黄精果聚糖和半乳聚糖的结构及其在益生菌中的应用[d]. 四川:成都中医药大学,2021.曹长靓. 海蒿子多糖的分离纯化、降血糖活性及其体外消化酵解研究[d]. 广东:华南理工大学,2021.）。
5、（2）弱信号峰的糖残基解析不准确甚至无法解析：由于核磁共振灵敏度低，检出限高，导致糖链中含量低的糖残基以及糖苷键等只能在核磁图谱中出弱信号峰或者不出峰。现有技术人员解析弱信号峰只能基于自身知识水平进行估计解析，或者直接舍弃该弱信号峰，因此导致弱信号峰对应的糖残基结构解析不准确甚至无法解析，进而使得多糖结构解析不完整。目前针对多糖结构的解析包括分子量，单糖组成，官能团，糖残基以及糖苷键连接方式等，主要解析多糖的主链以及含量丰富的侧链结构，但侧链结构因为含量低导致在检测图谱中表现为弱信号峰，在结构解析时解析不准确或无法解析导致多糖结构解析不完整。完整的多糖结构是指在分子量，单糖组成，官能团，糖残基以及糖苷键连接方式等解析的主链结构基础上，进一步解析多糖的侧链结构，并基于分子量，对重复单元数进行合理判断，如果只是解析了上述部分结构信息则得到的是不完整的多糖结构。例如李雪琴在利用核磁解析柴胡多糖结构时，因为部分核磁信号太弱，而未出峰，因此没有得到该部分的糖苷键连接方式（李雪琴. 不同分子量柴胡多糖的结构解析及体外生物活性研究[d]. 山西:山西大学,2022.）；在dong yu-hao等人对桑葚多糖的研究中（yu-hao d, chun c, qiang h,xiong f. study on a novel spherical polysaccharide from fructus mori withgood antioxidant activity. carbohydr polym. 2021 mar 15;256:117516. ），可以看到氢谱中的信号峰5.07 ppm，4.99 ppm，4.60 ppm等和碳谱中的信号峰101.70ppm，77.51ppm等因信号太弱，而无法解析，所以被舍弃。国家标准gb/t 27417—2017中指出仪器检出限是指用仪器可靠地将目标分析物信号从背景（噪音）中识别出来时，分析物的最低浓度或量（陈雷,刘红兵,刘惠丽. 定量nmr中多种检出限评估方法的比较[j]. 波谱学杂志,2022,39(2):230-242. doi:10.11938/cjmr20212944.）；王东云的研究中记载，在分析天然产物中，核磁共振仪的检出限较其它波谱分析仪器高，这对于产率较低的天然产物化合物来说无疑是一种瓶颈制约因素；同样的，刘雅琴等人的研究中记载，低灵敏度一直是(并将继续是)核磁共振生物分析应用的致命弱点，而提高核磁共振灵敏度一直是过去四十年来大多数技术发展的焦点。另外，由于多糖有结构复杂且分支结构丰富，各成分之间相互干扰导致核磁共振检出限高；（刘雅琴,余明新,何玲.核磁共振技术在药物检测中的应用进展[j].天然产物研究与开发,2022,34(11):1971-1977.doi:10.16333/j.1001-6880.2022.11.018.；王东云.核磁共振技术及应用研究进展[j].科技信息(学术研究),2008(27):353-354.）；因此在检测条件的限制下，由于多糖分子量大，溶解度低，使得核磁出峰信号中，多糖中某些本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种基于分离的分段同源多糖组的多糖结构解析方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（5）中，所述核磁解析包括将具有相似结构的同源多糖组内的多糖进行核磁分析，利用核磁信号的相似性，互相辅助解析完整的多糖结构，所述互相辅助解析的步骤如下：
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤（1）分离出同源多糖之前，还包括纯化粗多糖的步骤，所述纯化粗多糖包括去除色素和去除蛋白质的步骤。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）中，所述分离出同源多糖的步骤为采用NaCl全浓度或多浓度洗脱。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）中，所述绘制洗脱曲线的方法为利用苯酚硫酸法测定碳水化合物含量，从而绘制洗脱曲线。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2）中，所述构建分段同源多糖组可以任意选取多段洗脱曲线范围内的n种多糖，透析，冻干样品。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（3）中，所述纯度和分子量采用凝胶渗透色谱测定。>
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（5）中，所述糖苷键的分析采用酶解法。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述酶解法的条件为将1～2 mg/ml的同源多糖糖液分别与α-1,5-阿拉伯聚糖内切酶，β-1,4-半乳聚糖内切酶，α-1,4-半乳聚糖内切酶混合，37～40 ℃反应16～24 h。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（5）中，所述核磁解析的步骤具体包括：1）核磁共振波谱（NMR）分析所述分段同源多糖组中的每种多糖的结构信息；2）分析比较所述分段同源多糖组中的每种多糖的1H NMR图谱以及13C NMR图谱，确定所述分段同源多糖组中的每种多糖重合的信号峰，根据每种多糖之间的比较，确定重合的信号峰对应的糖残基；3）分别分析所述分段同源多糖组中的每种多糖的强信号峰，解析强信号峰的糖残基；根据同源多糖的相似性，利用所述分段同源多糖组中的每种多糖的强信号峰互相补充所述分段同源多糖组中的每种多糖的弱信号峰，解析得到完整的多糖结构；4）根据所述分段同源多糖组中的每种多糖的分子量，单糖组成，糖苷键，官能团、糖残基以及糖苷键连接顺序信息，判断多糖结构。
...【技术特征摘要】
1.一种基于分离的分段同源多糖组的多糖结构解析方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（5）中，所述核磁解析包括将具有相似结构的同源多糖组内的多糖进行核磁分析，利用核磁信号的相似性，互相辅助解析完整的多糖结构，所述互相辅助解析的步骤如下：
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤（1）分离出同源多糖之前，还包括纯化粗多糖的步骤，所述纯化粗多糖包括去除色素和去除蛋白质的步骤。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）中，所述分离出同源多糖的步骤为采用nacl全浓度或多浓度洗脱。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）中，所述绘制洗脱曲线的方法为利用苯酚硫酸法测定碳水化合物含量，从而绘制洗脱曲线。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2）中，所述构建分段同源多糖组可以任意选取多段洗脱曲线范围内的n种多糖，透析，冻干样品。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（3）中，所述纯度和分子量采用凝胶渗透色谱测定。
8.根...
【专利技术属性】
技术研发人员：赵晓勇，施丽婷，李鲜，刘意隆，刘雅琴，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：
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