本发明专利技术公开了一种3'‑磷酸腺苷‑5'‑磷酸硫酸盐合酶突变体及其应用，通过对3'‑磷酸腺苷5'‑磷酸硫酸盐合酶的氨基酸序列进行突变，得到了酶活性显著提高的3'‑磷酸腺苷5'‑磷酸硫酸盐合酶突变体Mu‑1、Mu‑2、Mu‑3，其活性分别为野生型3'‑磷酸腺苷5'‑磷酸硫酸盐合酶活性的197.14％，143.62％，116.75％。本发明专利技术采用3'‑磷酸腺苷5'‑磷酸硫酸盐合酶突变体作为催化剂，催化合成3'‑磷酸腺苷5'‑磷酸硫酸盐，并采用离子交换层析对3'‑磷酸腺苷5'‑磷酸硫酸盐进行分离纯化，进一步提高了3'‑磷酸腺苷5'‑磷酸硫酸盐产量，此合成方法不使用有毒有害溶剂、绿色环保、工艺简单易操作、收率高、纯度高且生产成本较低，有利于大规模生产。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因工程和酶工程领域，尤其涉及一种3′-磷酸腺苷-5′-磷酸硫酸盐合酶突变体及其应用。
技术介绍
1、硫酸化反应广泛存在于生物体内源性物质代谢及外源性物质化学修饰过程中，对细胞发育、分化、免疫、解毒等生物学功能作用显著。在生物体中，3′-磷酸腺苷-5′-磷酸硫酸盐(paps)是活性硫酸根供体，是细胞对无机硫酸盐的吸收和代谢至关重要的物质，硫酸转移酶催化paps的硫酸基团转移到对应的底物中合成硫酸化的代谢产物。上述硫酸化反应机制也用于体外酶法制备硫代葡萄糖苷、肝素、硫酸软骨素和氧氨喹等化合物。
2、在人体内合成paps的途径主要是依靠3′-磷酸腺苷5′-磷酸硫酸盐合酶(papss)。papss是哺乳动物体内生成paps的关键酶，在人体内发现两种类型的3′-磷酸腺苷5′-磷酸硫酸盐合酶papss1与papss2，都能够以atp、无机硫酸盐为底物一步催化合成paps。但是野生型3′-磷酸腺苷5′-磷酸硫酸盐合酶活性较低，无法用于工业生产，此外制备得到的paps难以分离纯化，使得生产效率低下，不适合规模化生产。
3、因此，构建稳定、高效的paps合成、纯化体系，对paps的高效合成十分重要。
技术实现思路
1、为解决上述问题，本专利技术提供了一种3′-磷酸腺苷5′-磷酸硫酸盐合酶突变体及其应用，采用酶活性显著提高的突变体作为催化剂，制备得到高纯度、高收率3′-磷酸腺苷5′-磷酸硫酸盐。
2、本专利技术解决上述问题的技术方案如下：
>3、一种3′-磷酸腺苷5′-磷酸硫酸盐合酶突变体，所述突变体是在野生型3′-磷酸腺苷5′-磷酸硫酸盐合酶的氨基酸序列seq id no.1、野生型3′-磷酸腺苷5′-磷酸硫酸盐合酶亚型的氨基酸序列seq id no.2的基础上进行如下突变得到：4、选择seq id no.1的n端前50个氨基酸进行不同长度截短或选择seq id no.2的n端前50个氨基酸进行不同长度截短，得到3′-磷酸腺苷5′-磷酸硫酸盐合酶突变体。
5、作为优选，所述突变体是如下突变之一得到的：
6、突变a：将野生型3′-磷酸腺苷5′-磷酸硫酸盐合酶的氨基酸序列从n端截短至第34位缬氨酸得到突变体mu-1；mu-1的氨基酸序列如seq id no.3所示；
7、突变b：将野生型3′-磷酸腺苷5′-磷酸硫酸盐合酶亚型的氨基酸序列从n端截短至第43位精氨酸得到突变体mu-2；mu-2的氨基酸序列如seq id no.4所示；
8、突变c：将野生型3′-磷酸腺苷5′-磷酸硫酸盐合酶的氨基酸序列从n端截短至第34位缬氨酸，并将野生型3′-磷酸腺苷5′-磷酸硫酸盐合酶氨基酸序列第207位的半胱氨酸突变为丝氨酸得到突变体mu-3；mu-3的氨基酸序列如seq id no.5所示。
9、本专利技术还提供了上述3′-磷酸腺苷5′-磷酸硫酸盐合酶突变体的编码基因。
10、本专利技术还提供了包含上述3′-磷酸腺苷5′-磷酸硫酸盐合酶突变体的编码基因的重组载体。
11、本专利技术还提供了包含上述重组载体的基因工程菌。
12、本专利技术的另一目的是，提供一种3′-磷酸腺苷5′-磷酸硫酸盐合酶突变体在制备3′-磷酸腺苷5′-磷酸硫酸盐中的应用。
13、本专利技术还提供了一种制备3′-磷酸腺苷5′-磷酸硫酸盐的方法，以atp盐、无机硫酸盐为底物，以上述3′-磷酸腺苷5′-磷酸硫酸盐合酶突变体为催化剂，在含氯化镁、氯化锂、缓冲液的溶液中进行催化反应，合成3′-磷酸腺苷5′-磷酸硫酸盐。
14、作为优选，所述atp盐的添加量为0.1～30mm，所述无机硫酸盐添加量为0.01～0.3m；所述氯化镁添加量为0.15～20mm，所述氯化锂添加量为0.15～45mm；所述3′-磷酸腺苷5′-磷酸硫酸盐合酶突变体的添加量为0.1～5mg/ml；所述催化反应ph值为5～10，温度为25～30℃，时间为0.5～24h。
15、作为优选，将所述3′-磷酸腺苷5′-磷酸硫酸盐进行分离纯化。
16、作为优选，将所述3′-磷酸腺苷5′-磷酸硫酸盐通过离子交换层析进行分离纯化。
17、本专利技术所述seq id no.1：
18、meipgslckkvklsnnaqnwgmqratnvtyqahhvsrnkrgqvvgtrggfrgctvwltglsgagkttvsmaleeylvchgipcytldgdnirqglnknlgfspedreenvrriaevaklfad aglvcitsfispytqdrnnarqihegaslpffevfvdaplhvceqrdvkglykkarageikgftgidseyekpeapelvlktdscdvndcvqqvvellqerdivpvdasyevkelyvpenklhlaktdaetlpalkinkvdmqwvqvlaegwatplngfmrereylqclhfdclldggvinlsvpivltathedkerldgctafalmyegrrvailrnpeffehrkeercarqwgttcknhpyikmvmeqgdwliggdlqvldrvywndgldqyrltptelkqkfkdmnadavfafqlrnpvhnghallmqdthkqllergyrrpvlllhplggwtkdddvplmwrmkqhaavleegvlnpettvvaifpspmmyagptevqwhcrarmvaganfyivgrdpagmphpetgkdlyepshgakvltmapglitleivpfrvaaynkkkkrmdyydsehhedfefisgtrmrklaregqkppegfmapkawtvlteyyksleka
19、本专利技术所述seq id no.2：
20、msgikkqktenqqkstnvvyqahhvsrnkrgqvvgtrggfrgctvwltglsgagkttisfaleeylvshaipcysldgdnvrhglnrnlgfspgdreenirriaevaklfadaglvcitsfispfakdrenarkihesaglpffeifvdaplnicesrdvkglykrarageikgftgidsdyekpetpervlktnlstvsdcvhqvvellqeqnivpytiikdihelfvpenkldhvraeaetlpslsitkldlqwvqvlsegwatplkgfmrekeylqvmhfdtlldgmalpdgvinmsipivlpvsaedktrlegcskfvlahggrrvailrdaefyehrkeercsrvwgttctkhphikmvmesgdwlvggdlqvlekirwndgldqyrltplelkqkckemnadavfafqlrnpvhnghallmqdtrrrllergykhpvlllhplggwtkdddvpldwrmkqhaavleegvldpkst本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种3'-磷酸腺苷5'-磷酸硫酸盐合酶突变体，其特征在于，所述突变体是在野生型3'-磷酸腺苷5'-磷酸硫酸盐合酶的氨基酸序列SEQ ID NO.1、野生型3'-磷酸腺苷5'-磷酸硫酸盐合酶亚型的氨基酸序列SEQ ID NO.2的基础上进行如下突变得到：
2.根据权利要求1所述的一种3'-磷酸腺苷5'-磷酸硫酸盐合酶突变体，其特征在于，所述突变体是如下突变之一得到的：
3.权利要求1～2任一项所述的3'-磷酸腺苷5'-磷酸硫酸盐合酶突变体的编码基因。
4.包含权利要求3所述的3'-磷酸腺苷5'-磷酸硫酸盐合酶突变体的编码基因的重组载体。
5.包含权利要求4所述的重组载体的基因工程菌。
6.权利要求1～2任一项所述的一种3'-磷酸腺苷5'-磷酸硫酸盐合酶突变体在制备3'-磷酸腺苷5'-磷酸硫酸盐中的应用。
7.一种制备3'-磷酸腺苷5'-磷酸硫酸盐的方法，其特征在于，以ATP盐、无机硫酸盐为底物，以权利要求1～2任一项所述3'-磷酸腺苷5'-磷酸硫酸盐合酶突变体为催化剂，在含氯化镁、氯化锂、缓冲液的溶液中进行催化反应，合成3'-磷酸腺苷5'-磷酸硫酸盐。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述ATP盐的添加量为0.1～30mM，所述无机硫酸盐添加量为0.01～0.3M；所述氯化镁添加量为0.15～20mM，所述氯化锂添加量为0.15～45mM；所述3'-磷酸腺苷5'-磷酸硫酸盐合酶突变体的添加量为0.1～5mg/mL；所述催化反应pH值为5～10，温度为25～30℃，时间为0.5～24h。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，将所述3'-磷酸腺苷5'-磷酸硫酸盐进行分离纯化。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，将所述3'-磷酸腺苷5'-磷酸硫酸盐通过离子交换层析进行分离纯化。
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【技术特征摘要】
1.一种3'-磷酸腺苷5'-磷酸硫酸盐合酶突变体，其特征在于，所述突变体是在野生型3'-磷酸腺苷5'-磷酸硫酸盐合酶的氨基酸序列seq id no.1、野生型3'-磷酸腺苷5'-磷酸硫酸盐合酶亚型的氨基酸序列seq id no.2的基础上进行如下突变得到：
2.根据权利要求1所述的一种3'-磷酸腺苷5'-磷酸硫酸盐合酶突变体，其特征在于，所述突变体是如下突变之一得到的：
3.权利要求1～2任一项所述的3'-磷酸腺苷5'-磷酸硫酸盐合酶突变体的编码基因。
4.包含权利要求3所述的3'-磷酸腺苷5'-磷酸硫酸盐合酶突变体的编码基因的重组载体。
5.包含权利要求4所述的重组载体的基因工程菌。
6.权利要求1～2任一项所述的一种3'-磷酸腺苷5'-磷酸硫酸盐合酶突变体在制备3'-磷酸腺苷5'-磷酸硫酸盐中的应用。
7.一种制备3'-磷酸腺苷5...
【专利技术属性】
技术研发人员：张博，柳志强，江小涵，陈勇贞，张泽昊，郑裕国，
申请(专利权)人：杭州裕元生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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